表皮生长因子及受体与增生性玻璃体视网膜病变

　　作者：张磊,孙晓东　　作者单位：200080)中国上海市，上海交通大学附属第一人民医院眼科

　　【摘要】表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)与其受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)结合后可通过特定的信号传导通路调节细胞的增生、迁移、粘附等活动。研究发现EGF/EGFR可诱导视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞增生、移行，从而促进增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)的发生发展。我们通过本文从EGF/EGFR的结构、功能、参与PVR形成的机制等方面进行综述，并展望拮抗EGF/EGFR信号传导通路的方法在治疗PVR上的应用前景。

　　【关键词】 表皮生长因子及受体;增生性玻璃体视网膜病变;增生;迁移

　　增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是导致视网膜脱离手术失败的最主要的原因，发生率为10%，其特征性的表现为视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial,RPE)脱离原位，首先发生移行至玻璃体腔或视网膜表面，继而增生并与胶质样细胞、巨噬细胞和成纤维样细胞等共同组成PVR纤维增生膜。由于膜的收缩和牵拉，导致视网膜形成固定皱襞，导致视网膜脱离复发，引起视功能的严重丧失[1]。越来越多的研究发现表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)及其受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)在RPE细胞的迁移、增生中起重要作用，是促进RPE细胞发生迁移进而发生PVR过程的关键因素之一，本文我们将从EGF/EGFR的结构、功能、参与PVR形成的机制等方面进行综述，并展望拮抗EGF/EGFR信号传导通路的方法在治疗PVR上的应用前景。

　　1 EGF/EGFR的基本结构和生物学功能

　　1.1 EGF的基本结构 EGF 是最早确立结构的生长因子, 等电点为4.6, 分子量为6045Da,是由53个氨基酸残基组成的分子多肽,含3个链内二硫键[2]。EGF分子的空间结构可分为相对独立的N段和C段,分别由两对和一对二硫键相连。在功能上,人表皮生长因子(hEGF)分子的N结构域可能对受体结合是重要的, 而C结构域可能对促细胞生长的活性是重要的。EGF需与相应的受体(如EGFR)结合才能发挥相应的生物学效应。

　　1.2 EGFR的基本结构 表皮生长因子受体(EGFR)[3]是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，是鸟类成红细胞白血病病毒致癌基因同源体，为HER/ErbB家族的四个成员之一，故又名HER1或ErbB1。属于受体酪氨酸激酶。EGFR全蛋白分为胞外域、跨膜区、胞内域三部分。当EGFR受到配体刺激时,胞外域发生构象变化并进一步解除胞内域的自抑制,通过胞内域之间的反式激活产生RTK活性，进而启动EGFR信号通路,完成细胞信号从细胞外向细胞内的传导与转移过程。

　　2 EGF/EGFR的传导通路

　　EGFR信号转导通路主要有：Ras/Raf/MEK/ERK通路、PI3K/PDK1/PKB(Akt)通路、PLCγ通路、JAK/STAT通路、cSrc通路[4]。 通过这些通路将有丝分裂信号从细胞外传递到细胞内, 从而有效调节细胞对外界刺激的反应、细胞增生、存活、粘附、迁移和分化、细胞存活及生长状况等。现在研究的较多的是MAPK通路以及PI3K通路。

　　2.1 MAPK通路[5] 作为EGFR的靶物，丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)包括Erk1/2，Erk5，Jnks，p38等不同种类。以Erk1/2为例，紧随着近膜信号的发生，如Shc和Grb2聚集到酪氨酸磷酸化的受体上后，鸟苷酸交换因子Sos结合Grb2，活化Ras蛋白，随后诱导丝氨酸/苏氨酸激酶Raf和MEK1/2 激酶特异性地激活Erk1/2，最终通过调节转录因子，如Elk1，cfos，提高基因表达水平。

　　2.2 PI3K通路 EllertMiklaszewska等[6]研究提出配体激活EGFR后，Gab1被磷酸化，作为船坞蛋白招募大量的下游信号蛋白，特别是磷酯酰肌醇3位羟基激酶( phosphatidylino sitol3kinase,PI3K)。在EGF的刺激下PI3K催化磷酸肌醇二磷酸(phosphatidy linositol (4,5)bisphosphate, PIP2)磷酸化形成磷酸肌醇三磷酸(phosphatidy linositol(3,4,5)trisphosphate,PIP3)，PIP3继续与磷脂酰肌醇依赖性激酶1(phosphoinositidedependent kinase1,PDK1)上的PH结构域结合，后者又通过自身的PIKpocket作用于底物，包括PKB，SGK，AGC，PKC等蛋白激酶。其中，PKB(蛋白激酶B,又称Akt)是PI3K下游一个重要的靶子，Akt 蛋白可以分为Akt1，Akt2，Akt3三种亚型，不同亚型在细胞中起不同作用。Akt可促使大量蛋白磷酸化以调控细胞的存活、凋亡、迁移等活动。最近研究[7]发现Akt2与癌细胞细胞迁移密切相关。PKC家族由12个丝氨酸/苏氨酸激酶组成[8]，是PI3K的下游分子。根据活化机制将其分为三类，一类称为Classic PKC，如PKCα，βI，βII，γ，这类PKC的活化需要甘油二酯和钙;一类称为Novel PKC，如δ，ε，θ，η，这类PKC的活化需要甘油二酯，但不需要钙;一类称为Atypical PKC，如ζ，λ，这类PKC的活化既不需要甘油二酯也不需要钙[9]。在肿瘤和神经元[10]研究中已经证明PKC尤其是PKCα，δ，ζ参与多种细胞极化、趋化、迁移，粘附等相关信号的传导，在细胞的迁移中起着主要的作用。

　　3 EGF/EGFR的生物学效应

　　3.1促使肿瘤细胞转移 近年研究发现EGF/EGFR在肿瘤转移中发挥重要作用。肿瘤分子趋化迁移是肿瘤转移的启动因素,Price等[11]在研究人乳腺癌细胞MDAMB231对EGF刺激的反应时发现，EGF并不能引起该细胞增生，而是通过PI3K及PLC途径介导细胞的趋化迁移。Sun等[12]进一步研究人乳腺癌细胞MDAMB 231中EGF介导的迁移信号传导通路时发现，在EGF刺激下，特异性抑制PKC的活性时细胞趋化能力较对照组减弱，说明PKC参与了EGF介导的细胞趋化，且其移位反应受到PI3K调控。Wang等[13]通过siRNA技术抑制人乳腺癌细胞中AKT2的表达，实验发现在等量EGF刺激下，siAkt2细胞较Akt2正常表达的细胞迁移能力显著减弱。进而证实了AKT2参与了EGF诱导的人乳腺癌细胞的趋化迁移。此外，Wang等还分别抑制PDK1，Akt2以及PKCζ的作用，以研究其他两者磷酸化的情况，实验结果证实，PDK1作为Akt2的上游分子， PKCζ作为AKT2的下游分子也参与此通路的迁移信号传导。新近一些实验证实，Akt作为PI3K的下游信号分子通过调节基因转录从而调控肿瘤细胞的迁移[7，14]。同时EGF还能促进某些肿瘤细胞释放某些金属酶,该酶具有破坏组织细胞间质的作用，从而促进肿瘤向外播散转移[15]。

　　3.2调节细胞增生分化 EGF/EGFR可促进表皮、肝、神经干、胃肠粘膜上皮、角膜上皮细胞等多种外胚层和内胚层起源的人体组织细胞的增生和分化。其机制为EGF/EGFR在特定细胞中通过特定的信号传导通路，促进糖酵解及蛋白质、RNA和DNA的合成，从而促使细胞分裂和增生。

　　3.3调节细胞间质的合成 EGF能够刺激角膜基质和纤维细胞增生，改善角膜胶原纤维板层的排列使其更接近于正常的排列趋势。在创面的愈合活动中，EGF也有类似作用。

　　4 EGF/EGFR在增生性玻璃体视网膜病变形成中的机制

　　PVR是严重危及人眼视力的过度损伤修复反应，RPE细胞的移行、增生是其基本的病理过程。EGF，VEGF，PDGF，TGF等细胞因子可通过自分泌、旁分泌、内分泌等方式作用于RPE细胞，并与相应配体结合后启动一系列级联反应，调控RPE细胞的增生、迁移，进而影响PVR的形成与发展[16，17]。近年研究表明EGF/EGFR在促进RPE细胞发生迁移，形成PVR过程中起着重要作用。

　　4.1 PVR患者中EGF、EGFR的表达增多 首先，PVR患者中EGF的表达增多，且与PVR的发生及病情程度相关。Hollborn等[18]研究发现在PVR患者的RPE细胞中，EGF及EGF相关生长因子家族的表达显著增高。并且在PVR患者的视网膜下液及玻璃体腔内，也可检测到EGF等细胞因子的表达[19]，进而推测EGF与PVR的发生有关。Liu等[20]研究发现人RPE细胞表达EGFR,陈明等[21]经免疫荧光细胞染色法也获得同样结果。阎峰等[22]用免疫组化及原位杂交技术检测出，EGFR基因及蛋白主要表达于PVR的早期膜中，并推测在PVR病变早期，EGFR与其配体结合形成复合物后具有生物学活性，促进PVR的发生、发展。

　　4.2 EGF/EGFR促进PVR发生发展的机制 EGF促进PVR发生发展的机制与其可促进RPE细胞迁移及增生的作用有关， Cao等[23]和Spraul等[24]发现EGF等生长因子可促使人和牛RPE细胞的DNA合成增加。在体外培养条件下，EGF被实验证实[25]可促进人RPE细胞在损伤愈合过程中的迁移、增生，并可引起其形态改变。闫峰等[26]通过对人RPE细胞采用MTT比色法及PRE细胞损伤模型研究，也证实EGF对RPE细胞增生和移行具有促进作用，且此作用呈浓度依赖性。EGF刺激RPE细胞增生、移行的具体机制尚不明确，但根据以往对体细胞及肿瘤细胞的增生迁移机制的研究推测，EGFR/MAPK及EGFR/PI3K/PDK1/AKT2/PKC通路可能发挥主要作用。新近，一些实验结果也证实了此推测。国内，闫峰等[27]发现EGFR基因及蛋白主要表达于PVR的早期膜的基础上，又发现EGF呈浓度依赖性地促进RPE细胞EGFR mRNA及蛋白质的表达，且对MAPK也具有浓度依赖性的核转位作用,因此推测EGF可活化EGFR，并介导EGFRMAPK通路，此通路与PVR发生有关。Yan等[28]也通过实验发现EGF能浓度依赖性地促进细胞的增生、迁移。在EGF刺激下人PRE细胞的EGFR表达增加，ERK1/2由胞膜移位至胞核内。表明EGF可介导EGFRMAPKERK通路，促进人RPE细胞的增生、迁移。国外Hecquet等[29]采用特异性抑制Ras/Raf/MEK/ERK通路中某一分子的活性以研究其下游分子的表达及对RPE细胞增生的影响，结果提示此通路在RPE细胞增生活动中起关键作用。Saika等[30]利用P38MAPK抑制剂和dominant negative(DN)p38MAPK，研究了TGFp38MAPK通路对RPE细胞的调节作用，结果也表明TGFp38MAPK通路与RPE细胞迁移密切相关，证明MAPK通路参与了EGF刺激下的RPE细胞迁移和增生。最新研究发现在介导肿瘤细胞迁移中起重要作用的信号传导通路EGFR/PI3K/PDK1/AKT2可诱导人晶状体上皮细胞移行[31]，EGF还可诱导晶状体上皮细胞的EGFR和AKT磷酸化，而抑制AKT磷酸化的发生时细胞的移行也受到抑制。Xu等[32]通过RPE细胞的伤口愈合实验发现其迁移信号的传导可通过EGFR及其下游PI3K通路实现，采用EGFR抑制剂AG1478可以阻断RPE细胞的迁移。Hollborn等[18]的研究结果表明HBEGF能够活化PI3K通路，并刺激RPE细胞中Akt磷酸化。EGFR/PI3K/PDK1/AKT2/PKCζ传导通路在人RPE细胞中的作用及机制尚未完全明了，仍需大量的实验论证。

　　5问题与展望

　　PVR的早期发生机制尤其是调节RPE细胞发生迁移、增生的调控机制尚未完全明确，但是RPE细胞的迁移、增生是导致PVR发生和发展的关键因素之一。国内外的研究已初步证实，EGF可以通过活化EGFR，并通过特定的信号传导通路，介导RPE细胞的异常迁移、增生，从而引发PVR。但是具体的信号传导通路尚未完全明确，并且细胞的迁移是多种信号通路协同作用的结果，各条信号传导通路之间存在着交叉联系，因此筛选出EGF刺激RPE细胞迁移机制中的关键分子，可为今后设计和寻找拮抗剂通过拮抗信号分子传导来抑制RPE细胞的迁移行为提供理论依据。

　　【参考文献】

　　1 RoldánPallarés M, Rollín R, Mediero A, et al. Immunoreactive ET1 in the vitreous humor and epiretinal membranes of patients with proliferative vitreoretinopathy. Molecular Vision 2005;11:461471

　　2曾嵘,邵晓霞,夏其昌.人表皮生长因子胎谱及一级结构质谱法分析.生物化学与生物物理学报 1999;31(1):3136

　　3 Hubbard SR, Miller WT. Receptor Tyrosine Kinases: Mechanisms of Activation and Signaling. Current Opinion in Cell Biology 2007;19(2):117112

　　4 Sebastian S, Settleman J, Reshkin SJ. The complexity of targeting EGFR signaling in cancer: from expression to turnover. Biochim Biophys Acta 2006;1766 (1):120139

　　5 Prenzel N, Fischer OM, Streit S, et al. The epidermal growth factor receptor family as a central element for cellular signal transduction and diversification. Endocr Relat Cancer 2001;8(1):1131

　　6 EllertMiklaszewska A,Kaminskab B,Konarska L.Cannabinoids downregulate PI3K/Akt and Erk signaling pathways and activate proapoptotic function of Bad protein. Cell Signal 2005;17(1):2537

　　7 Altomare DA, Testa JR. Perturbations of AKT signaling pathway in human cancer. Oncogene 2005;24(50):74557464

　　8 Wen HC,Huang WC,Ali A, et al. Negative regulation of phosphatidylinositol 3kinase and Akt signaling pathway by PKC. Cellular Signaling 2003;15(1):3745

　　9 Toker A. Signaling through protein kinase C. Front Biosci 1998;3(1):11341147

　　10 Higginbotham H, Tanaka T, Brinkman BC, et al. GSK3 beta and PKC zeta function in centrosome localization and process stabilization during Slitmediated neuronal repolarization. Mol Cell Neurosci 2006;32(12):118132

　　11 Price JT, Tiganis T, Agarwal A, et al. Epidermal growth factor promotes MDAMB231 breast cancer cell migration through a phosphatidylinositol 3kinase and phospholipase Cdependent mechanism. Cancer Res 1999;59(21):54755478

　　12 Sun R, Gao P, Chen L, et al. Protein kinase C zeta is required for epidermal growth factorinduced chemotaxis of human breast cancer cells. Cancer Res 2005;65(4):14331441

　　13 Wang J,Wan W,Sun R, et al. Reduction of Akt2 expression inhibits chemotaxis signal transduction in human breast cancer cells. Cellular Signaling 2008;20(6):10251034

　　14 Toker A, YoeliLerner M. Akt signaling and cancer: surviving but not moving on. Cancer Res 2006;66(8):39633966

　　15 Le Riche VK, Asa SL, Ezzat S. Epidermal growth factor and its receptor (EGFR) in human pituitary adenomas, EGFR correlates with tumor aggressiveness. J Clin Endocrinol Metab 1996;8(2):656662

　　16 Limb GA, Little BC, Mcager A, et al. Cytokines in proliferative vitreoretinopathy. Eye 1991;5(Pt 6):686693

　　17张妍，苏冠方，吴宏.生长因子对视网膜色素上皮的作用.国际眼科杂志 2007;3(7)：766768

　　18 Hollborn M, Iandiev I, Seifert M, et al. Expression of HBEGF by retinal pigment epithelial cells in vitreoretinal proliferative disease. Curr Eye Res 2006;31(10):863874

　　19 Baudouin C, FredjReygrobellet D, Brignole F, et al. Growth factors in vitreous and subretinal fluid cells from patients with proliferative vitreoretinopathy. Ophthalmic Res 1993;25(1):5259

　　20 Liu NP, Fitzgibbon F, Nash M, et al. Epidermal growth factor potentiates the transmitter induced stimulation of cAMP and inosito phosphates in human pigment epithelial cells in culture. Exp Eye Res 1992;55:489497

　　21陈明,洪晶,高殿文,等.人视网膜色素上皮细胞表皮生长因子受体检测及定量分析.中华眼底病杂志1999;15(3):177

　　22阎峰，惠延年，马吉献,等.表皮生长因子受体在增生性玻璃体视网膜病变视网膜周膜中的表达.眼科新进展 2003;23(1)：810

　　23 Cao J, Zhang H, Liu N. The modulation of cell proliferation induced by growth factors in human retinal pigment epithelial cells. Zhong hua Yan Ke Za Zhi 1997;33(5):360362

　　24 Spraul CW, Kaven C, Lang GK, et al. Effect of growth factors on bovine retinal pigment epithelial cell migration and proliferation. Ophthalmic Res 2004;36(3)：166171

　　25陈明，蓝平，高明宏,等.表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及5氟尿嘧啶对培养的人视网膜色素上皮损伤愈合的体外研究.中华眼科杂志 1999;35(2)：134137

　　26闫峰，惠延年，王雨生，等.表皮生长因子对人视网膜色素上皮细胞增生及移行的影响.眼科新进展 2004;24(6):417421

　　27闫峰,惠延年,刘少山，等.人视网膜色素上皮细胞增生中表皮生长因子表皮生长因子受体有丝分裂原激活蛋白激酶信号传导途径的激活及其作用.中华眼底病杂志 2004;20(2):104107

　　28 Yan F, Hui YN, Li YJ, et al. Epidermal growth factor receptor in cultured human retinal pigment epithelial cells. Ophthalmologica 2007;221(4)：244250

　　29 Hecquet C, Lefevre G, Valtink M, et al. Activation and role of MAP kinasedependent pathways in retinal pigment epithelial cells: ERK and RPE cell proliferation. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002;43(9):30913098

　　30 Saika S, Yamanaka O, Ikeda K, et al. Inhibition of p38MAP kinase suppress fibrotic reaction of retinal pigment epithelial cells. Laboratory Investigation 2005;85(7):838850

　　31蒋沁,万寅生,毕志刚,等.EGF通过PI3K/AKT通路诱导人晶状体上皮细胞移行.眼科新进展 2007;27(5):344348

　　32 Xu KP,Yu FS.Cross talk between cMet and epidermal growth factor receptor during retinal pigment epithelial wound healing. Invest Ophthalmol Vis Sci 2007;48(5):22422248