SARS-CoV S240蛋白与眼部ACE2受体作用机制的研究

　　作者：孙琰,柳林,潘欣,景明　　　　

　　【摘要】 目的：研究SARS冠状病毒(SARS-CoV)S240蛋白与眼部功能性受体-血管紧张素转化酶2(ACE2)作用的机制。方法：构建SARS-CoV S蛋白融合基因pS240-EGFP，并在哺乳动物细胞中表达;半定量RT-PCR和免疫组化鉴定ACE2在结膜、角膜中的表达;酶联免疫吸附实验、流式细胞仪检测法进行SARS-CoV S240蛋白与结膜、角膜细胞的体外结合研究。结果：构建了融合基因pS240-EGFP;证实ACE2在结膜、角膜有表达;结膜、角膜细胞与SARS-CoV S240蛋白能够结合。 结论：结膜、角膜中存在SARS冠状病毒的功能性受体，SARS-CoV S240蛋白与结膜、角膜细胞能够结合。 本研究对了解SARS的病理机制及进一步研究SARS的防护和治疗具有一定的参考意义。

　　【关键词】 严重急性呼吸综合征 冠状病毒 S240蛋白 受体 血管紧张素转化酶2 结合作用

　　0引言

　　非典型肺炎即严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)，具有高度传染性与致病性，其致病因子为一种新型冠状病毒-SARS冠状病毒(SARS-CoV)，基因组结构为：5’-帽状结构-复制酶(rep)-棘突糖蛋白(S)-小包膜蛋白(E)-膜糖蛋白(M)-核衣壳蛋白(N)-多聚核苷酸(polyA)尾-3’。 S蛋白介导了病毒与宿主细胞的结合， SARS-CoV的功能性受体是血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2-ACE2)。本研究用293T细胞表达出了包含SARS-CoV S蛋白结合功能区域的pS240-EGFP融合蛋白片段，体外培养了人结膜、角膜细胞，检测了SARS-CoV的功能性受体ACE2在人结膜、角膜中的表达，并进行了非洲绿猴肾细胞(Vero E6 Cell)、人结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞和角膜上皮细胞与SARS-CoV S240-EGFP融合蛋白片段的体外结合实验研究。

　　1材料和方法

　　1.1材料 SARS-CoV S(基因组原型GenBank登录号为：AY278554)基因片段SⅠ(1～1 650nt)DNA片段。ACE2引物序列(accession number AF291820)：上游引物5’-CATTGGAGCAAGTGTTGGATCTT-3’，下游引物5’-GAGCTAATGCATGCCATTCTCA-3’，扩增片段长度为107个碱基。GAPDH: 上游引物5’-TGGGCTACACT GAGCACCAG- 3’, 下游引物5’-AAGTGGTCGTTGAGGG CAAT-3’，扩增片段长度为100个碱基。由上海博亚生物工程公司合成。PCR产物克隆载体pMD-18T(TaKaRa公司);质粒pEGFP-N1(Clontech公司);脂质体转染试剂Lipofectamine TMReagent(Invitrogen公司); Mammalian Protein Extraction Reagent哺乳动物细胞蛋白抽提液(PIERCE公司); SABC-AP免疫组化染色试剂盒(Santa-Cruz公司);SARS患者恢复期血清(使用前经56℃加热30min进行灭活，获自北京小汤山医院与解放军309医院)。主要抗体：角蛋白Keratin Pan，波形蛋白Vimentin，神经纤维丝蛋白NF kappa B(上海友谊中联生物工程有限公司);抗鼠辣根标记的二抗(上海华美生物工程有限公司);羊抗人ACE2多克隆抗体(R&D公司)。组织来源：3～6mo中期引产胎儿的角膜、结膜、心、肺组织，男女不限;成人眼球破裂伤摘除的角膜和结膜组织;尸体解剖的成人心、肺、脑组织由长海医院提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 pEGFP-N1及pS240-EGFP融合蛋白的表达 PCR引物：SRF: 5'-GAATTCGCCACCATGCAGACCTCTAAT TTCAGGGTTG-3'(斜体为EcoRI酶切位点);SRR: 5'-TCTAGATTAGGGATCCATCTCGAGAGGAGTTAACACACCA GTAC-3'(斜体分别为XbaI、BamHI、XhoI酶切位点)。基因工程方法构建真核表达质粒pMD-S240，进一步构建pS240-EGFP融合蛋白表达质粒。利用脂质体介导转染法将pEGFP-N1、pS240-EGFP分别转染293T细胞并进行克隆培养;细胞蛋白抽提液裂解细胞并进行透析，荧光分光光度计检测透析前后荧光光度值;Braford法检测蛋白质浓度;Western Blot法分析基因表达产物。

　　1.2.2 ACE2在人结膜、角膜的表达 体外培养人结膜上皮细胞、角膜上皮细胞、结膜成纤维细胞并行ELISA法鉴定。抽提组织(或细胞)的总RNA，鉴定RNA纯度、浓度和完整性;半定量RT-PCR;琼脂糖凝胶电泳;经复日紫外及可见图像识别分析系统(上海复日科技公司)进行电泳条带光密度扫描，以光密度积分值比值ACE2/GAPDH代表mRNA的表达水平，实验重复3次，数据使用SAS软件包处理。免疫组化法检测组织、细胞中ACE2的表达(SABC法)

　　1.2.3 S240-EGFP蛋白与各组织、细胞的结合 免疫酶标技术ELISA法：透析的各种组织及细胞蛋白抽提液与S240-EGFP蛋白进行结合试验，分别使用脑组织和Hela细胞及EGFP蛋白作为阴性对照，使用ACE2抗体进行阻滞研究。对所得的A 450值进行统计分析，使用SAS软件包，采用析因方差分析。流式细胞仪及荧光显微镜检测细胞与S蛋白的结合：检测结合后的荧光细胞。

　　2结果

　　2.1 pEGFP-N1及pS240-EGFP融合蛋白的表达 质粒琼脂糖凝胶电泳与DNA测序鉴定证明SARS-CoV S240-EGFP融合基因构建正确。转染的293T细胞在4～10h内观察到绿色荧光，12h后可观察到明显荧光。其中pEGFP-N1转染细胞的荧光较pS240-EGFP转染细胞的荧光稍强，细胞形态呈圆形。SARS-CoV pS240-EGFP基因表达产物的SDS-PAGE及Western Blot分析：相应分子质量处出现蛋白表达条带，与理论推算值相符。

　　2.2 ACE2在人结膜、角膜的表达 培养的人结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞和角膜上皮细胞，ELISA法鉴定细胞属性正确。抽取总RNA样品的浓度在0.12～0.5g/L之间、完整性良好、A 260/280比值为1.8～2.0之间的抽提样本，进行RT-PCR。半定量统计结果认为成人肺组织、成人心组织、成人结膜组织与成人角膜组织间及Vero细胞、结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞与角膜上皮细胞间ACE2-x与GAPDH-x的比值间的差异有统计学意义;levene法进行组间两两比较结果除了结膜上皮细胞与角膜上皮细胞间无显著差异外，其他各组织、细胞间均有显著差异。免疫组化法检测组织、细胞中ACE2的表达结果见文献[1]。

　　2.3 S240-EGFP蛋白与各组织、细胞的结合 免疫酶标技术ELISA法：细胞及组织蛋白抽提液浓度为10mg/L时，结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、结膜、角膜组织的蛋白抽提液与pS240-EGFP蛋白出现了比较明显的阳性结合反应，与Vero E6细胞及心、肺组织蛋白抽提液相比稍弱;HeLa细胞和脑组织蛋白抽提液与pS240-EGFP蛋白均没有出现阳性结合反应。相同浓度的上述组织、细胞蛋白抽提液中分别加入pEGFP-N1蛋白，均没有出现阳性结合反应。空白对照组为阴性反应。相同浓度的Vero E6细胞、结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、心、肺、结膜、角膜组织蛋白抽提液被ACE2抗体孵育后，与pS240-EGFP蛋白没有出现阳性结合反应。用析因方差分析比较S240和EGFP在不同浓度(1mg/L和10mg/L)下与结膜上皮细胞、Vero、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、HeLa的结合能力，结果显示：S240-EGFP的结合能力比EGFP强，均数分别为0.2676，0.0092，10mg/L浓度比1mg/L浓度结合能力强，均数分别为0.2663，0.0105。在比较的各种细胞中，Vero的结合能力最强，均数为0.2661，结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、结膜上皮细胞的结合能力相当，均数分别为：0.1393，0.1392，0.1377，HeLa的结合能力最差，均数为0.01。经过比较，以10mg/L浓度的S240与Vero的结合能力最强，均数标准差为1.0319±0.0072。用同样的方法比较S240和EGFP在不同浓度(1mg/L和10mg/L)下与心、肺、结膜、角膜、脑5种组织的结合能力，结果如下：S240的结合能力比EGFP强，均数分别为0.3190，0.0071，10mg/L浓度比1mg/L浓度结合能力强，均数分别为0.3177，0.0084。在比较的各种组织中，心、肺组织的结合能力最强(二者无差异)，均数分别为0.2653，0.2648，结膜组织和角膜组织的结合能力为其次(二者无差异)，均数分别为：0.1395，0.1389，脑组织的结合能力最差，均数为0.0067。经过比较，以10mg/L浓度的S240与肺组织、心组织的结合能力最强，均数标准差分别为1.0366±0.0070，1.0365±0.0060。流式细胞仪检测结果显示：从细胞荧光指数观察，Vero E6细胞、结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞与pEGFP-N1蛋白均没有明显的结合;Vero E6细胞与pS240-EGFP蛋白出现了较明显的结合，结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞与pS240-EGFP蛋白也表现出一定的结合，但较Vero E6细胞明显要弱;上述细胞预先被ACE2抗体孵育后，与pS240-EGFP蛋白的结合明显被阻滞;而ACE2同种异型抗体没有能够阻滞上述细胞与pS240-EGFP蛋白的结合。

　　3讨论

　　呼吸道病毒能够侵犯眼部，引起眼部的感染，如病毒性结膜炎和角膜炎等，WHO把泪液作为可能藏有SARS-CoV的体液之一。很多医务工作者如眼科医生与患者的眼部近距离接触，可能形成SARS-CoV在医务工作者和患者之间的传播。还有可能通过应用眼部检查设备，造成病毒在患者之间的传播。

　　因为SARS-CoV的高传染性和高致病性，目前大多数有关SARS-CoV的研究无法使用真正的活病毒来进行，替而代之的是构建SARS-CoV的结构或功能蛋白，从蛋白质水平进行相关的研究。SARS-CoV S蛋白属于I型膜蛋白, 为1 255个氨基酸残基组成的病毒表面突起糖蛋白前体，以三聚体形式存在, 是构成病毒表面冠状结构的主要成分，也是病毒和宿主细胞受体结合及病毒诱发机体产生抗体或细胞性免疫反应的重要因子，S蛋白识别和结合宿主细胞上的受体主要借助于其N端的S1片段[2,3]。Wong等[4]研究显示在S318-510之间集中了SARS-CoV S蛋白受体结合区域，比全长S1蛋白具有更好的可溶性和折叠性，能更有效地结合ACE2及阻滞S蛋白介导的病毒与细胞之间的结合。Li等[5]，Xiao等[6]，Wong等[4]，已经利用人肾细胞株293或293T细胞表达了重组的全长S蛋白或S蛋白片段，并将其应用于SARS-CoV S蛋白的结合研究。这里，我们成功构建了包含SARS-CoV S蛋白结合功能单位的S240-EGFP融合蛋白，并将其在293T细胞中进行了表达。通过克隆培养转染阳性的细胞，提高了融合蛋白的得率，同时也提高了细胞蛋白抽提液中目的蛋白的浓度，为开展SARS-CoV眼部入侵途径的研究建立了初步的技术平台。

　　SARS是一种高度传染性的疾病，主要是通过空气中的飞沫传播和粪便传播，侵犯下呼吸道，进一步导致肺损害和呼吸窘迫[7]，除此之外的传播途径目前还不清楚，尚没有临床资料发现SARS患者有角膜、结膜感染的眼部并发症出现。人类组织中ACE2表达的定位论证可以间接地推断SARS-CoV的感染途径和可能的体内传播和复制路线，实时定量PCR[8-12]及免疫组化研究表明[13]ACE2在人肺和小肠上皮细胞中大量表达，提示SARS-CoV入侵可能途径为呼吸道和胃肠道。本研究用半定量RT-PCR和免疫组化的方法鉴定了ACE2在人结膜和角膜组织中的表达及不同组织间表达的差异，证实人角膜和结膜组织及人结膜上皮细胞、角膜上皮细胞和结膜成纤维细胞中存在ACE2的表达，但表达量较人心、肺组织和Vero E6细胞要少。研究表明[2,3,5,14-18]，ACE2的表达量的多少与细胞与SARS-CoV S蛋白的结合能力有一定关系，而细胞结合研究中人结膜上皮细胞、角膜上皮细胞和结膜成纤维细胞与SARS-CoV S蛋白结合的能力与Vero E6相比明显要弱，这一结果与半定量RT-PCR的研究结果相符。分析原因可能还有：①结膜和角膜细胞中ACE2的表达主要位于胞浆，细胞膜上表达较少，无法充分发挥受体的功能;②我们构建的pS240-EGFP蛋白片段是通过转染的细胞裂解、抽提蛋白质而得到的，蛋白片段较大，而且没有进行蛋白质纯化，一定程度上影响了其与ACE2受体的结合;③ 已经有一些研究证实[13,19-21]，虽然有些细胞和组织含有ACE2的表达，但是并没有发现这些细胞和组织中有SARS病毒的复制和基因表达，其中的原理尚不十分明确，可能与病毒入侵这些组织和细胞需要某些辅助因子或复合受体有关;④虽然新加坡[22]的研究人员已经发现SARS患者的泪液中存在SARS-CoV，但目前尚没有临床资料证实SARS患者出现病毒性结膜炎和角膜炎的并发症，这些与我们的研究结果有某些相似。当然，如果能够利用非洲绿猴等SARS-CoV易感动物进行SARS-CoV S蛋白的在体结合研究甚至进行SARS-CoV活病毒的在体研究则能更加确凿地得到SARS-CoV眼部亲嗜性的证据。

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