壳聚糖纳米给药系统及其在眼科学领域的应用

　　作者：王丽曌,王雨生　　作者单位：710032)中国陕西省西安市，第四军医大学西京医院眼科 全军眼科研究所

　　【摘要】基于壳聚糖的纳米给药系统已成为药物治疗研究的热点之一。壳聚糖纳米给药系统除了具有一般纳米给药系统的特点，如靶向输送、可生物降解和缓释外，还具有其他载体不具备的如抑菌、止血、抗组织纤维化、辅助免疫、抗肿瘤和促进伤口愈合等特性。目前的研究结果已展示出在眼科疾病治疗中的应用前景。

　　【关键词】 壳聚糖 纳米微粒 给药系统 眼科学

　　0引言

　　纳米技术在生物领域的渗透形成了纳米生物技术，而纳米药物载体的研究是纳米生物技术的重点和热点之一。近年来，基于可生物降解的大分子多聚体的给药系统已成为临床用药的趋势。药物载体材料包括天然高分子和人工合成高分子聚合物。壳聚糖(chitosan)作为一种天然的可生物降解的线性聚合物，来源丰富，理化性质相对稳定，具有多种生物学活性，已成为被广泛关注的生物医学材料。壳聚糖及其衍生物已用于人工皮肤、可吸收缝线、止血材料、抗黏连剂和药物载体等方面的研究[1]。由于特殊的生理屏障，全身或局部给药治疗眼科疾病的效果受到限制，而纳米给药系统可能为眼部药物输送提供一种理想途径[2]。

　　1壳聚糖的基本特性

　　1.1理化性质[3,4]

　　壳聚糖是一种氨基多糖聚合物，是由天然无活性的甲壳素(chitin)经脱乙酰基后得到的。甲壳素大量存在于甲壳动物(如蟹、虾)的甲壳中，也存在于菌类、昆虫类、藻类细胞膜和高等植物的细胞壁中，每年的生物产量很高，仅次于纤维素，是地球上的第二大可再生资源，由于其不溶于普通溶剂而难以应用。壳聚糖的结构与纤维素十分相似，只是糖环C2上的乙酰氨基代替了羟基，这个乙酰氨基赋予壳聚糖特殊的特性，使其可以用于药物制剂方面。市场上可得到的壳聚糖平均分子质量约3800～20000Da，脱乙酰度约为66%～95%。壳聚糖呈弱碱性，有很强的亲水性，但不溶于水，在中性和碱性环境下稳定，可与盐酸和醋酸等无机和有机酸合成盐，故通常使用1%～3%的醋酸缓冲液作为壳聚糖溶液的溶剂。壳聚糖盐能溶于水，溶解度与脱乙酰度和溶液pH值有关。影响壳聚糖性质最重要的两个因素即是脱乙酰度(DD)和平均相对分子质量(Mr)。

　　1.2安全性

　　壳聚糖毒性非常低，实验鼠的LD50为16g/kg，接近于糖或盐[4]。医用壳聚糖经过深加工后提纯，不含任何颗粒和杂质，无致热源性和抗原性，无刺激性，无致炎性，是安全的机体用材料。Gooday[5]观察了壳聚糖膜植入小鼠背部皮下的体内降解过程，以及在体外37℃、pH7溶菌酶情况下的降解作用，结果表明壳聚糖为可生物降解聚合物，其生物降解性可由壳聚糖的脱乙酰度来调控，其降解速率与脱乙酰化程度呈负相关。CarrenoGomez等[6]指出壳聚糖的盐类具有细胞毒性，且盐酸盐毒性大于谷氨酸盐，又大于乳酸盐;而且分子量越大，毒性越大;并指出，戊二醛交联的壳聚糖微球也具细胞毒性。因而对于不同的壳聚糖材料药品需要进行严格的临床实验分析。

　　1.3成膜成粒性

　　壳聚糖可塑性强，经不同的加工可被制成多种形式，如颗粒、胶体、薄膜和纤维状等[3]，其中研究最多的是纳米颗粒，其表面特性有：(1)丰富的功能基团，如丰富的OH、NH3功能基团与表面电荷，可以吸附或包裹的方式灵活运载不同特性药物，且壳聚糖的加入不影响主药的理化性质，对其含量测定亦无干扰[7];(2)高的生物黏附作用和强的细胞间瞬间渗透能力，形成良好的生物黏附性、凝结能力和免疫刺激活性，用于口、鼻和胃肠等黏膜给药，并能吸附有毒金属，如汞、镉和铅等[8];(3)丰富的多糖链，能特异性地被细胞或组织所识别，可靶向将药物投递至病灶部位贮存释放。

　　2壳聚糖的生物学特性

　　2.1可生物降解性和生物相容性

　　壳聚糖在生物体内可被生物酶，如溶菌酶催化缓慢降解为对人体无毒的N乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖[9]，降解过程中产生的低分子量甲壳胺或其寡聚糖在体内也不积累，无免疫原性，最终经代谢可以CO2的形式由呼吸道排出体外，也可以糖蛋白的形式为人体吸收利用。陆放等[10]将自行制备的壳聚糖膜置于家兔眼球结膜下，发现其在兔眼结膜下可自行降解。Felt等[11]将壳聚糖溶液滴于角膜表面，角膜荧光素染色后用激光扫描仪观察，角膜对壳聚糖有良好的耐受性。Genta等[12]在实验兔的滴眼液中加入壳聚糖，未见任何眼部刺激症状。Di Colo等[13]研究了盐酸壳聚糖(ChHCL)植入物在兔眼部的作用效应，结果显示模型药物氧氟沙星在房水中的峰值浓度增加，但未见结膜充血、角膜水肿等刺激症状;对角膜内皮细胞活性、晶状体上皮和视网膜组织形态均无明显影响;对参与晶状体及视网膜代谢的酶，如乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(ALP)活性等也均无明显影响，说明壳聚糖不会造成兔眼部组织缺氧或损伤，对眼部无毒性。Di Colo等[14]后来的研究比较了针对同一模型药物氧氟沙星的盐酸壳聚糖(ChHCl)和N羧甲基壳聚糖(CMCh)眼液在兔眼内的穿透作用，再次证实二者均无眼部刺激性,虽然其在眼部的药物代谢动力学效应不同(前者增加了药物的眼内渗透作用，后者延长了角膜前表面的药物滞留时间)，但这些聚合物均增加了药物的生物利用度。

　　2.2抑菌性

　　很多研究已经证实壳聚糖及其衍生物对于细菌、真菌和病毒具有一定的抑制性，但关于抑菌机制的研究结果各家报道不一，多数认为是一般抗微生物的作用方式，如损伤细胞壁、改变细胞膜的通透性、影响蛋白质和核酸分子、抑制重要酶的作用等，或是其中的一种或几种的联合应用研究。壳聚糖对于不同微生物的抑制作用机制可能不同，既与壳聚糖的脱乙酰度、平均分子量的大小、浓度和来源有关，还受对象菌的种类、环境温度和pH值影响。Qi等[15]研究证实，相对于壳聚糖, 壳聚糖微球对猪霍乱沙门菌表面形态具有更大的抗菌活性。一般认为，对于Gˉ菌，主要是由于小分子的壳聚糖渗透进入到微生物细胞内，吸附细胞内带负电的细胞质，并发生絮凝作用，扰乱细胞正常的生理活动，从而杀灭细菌;而对于G+菌，主要是由于大分子的壳聚糖吸附在微生物细胞表面，形成一层高分子膜，阻止了营养物质向细胞内运输，从而起到杀菌和抑菌作用。对于其抑菌作用影响因素的研究，目前比较一致的结论是[16]：(1)分子大小相近的壳聚糖，抑菌能力随其分子量的增加而增加;(2)壳聚糖抑制细菌作用最强，对酵母菌次之，对真菌的抑制作用则相对较弱。壳聚糖对G+菌的抑制作用比对Gˉ菌强;(3)壳聚糖的抑菌能力随其浓度升高而增强，随环境介质的pH值升高而降低;(4)溶剂对壳聚糖的抑菌能力也有一定的影响，一般来说以醋酸为溶剂比其他溶剂强。郑连英等[17]观察了不同分子量的壳聚糖对埃希氏大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用,发现随着壳聚糖分子量降低，壳聚糖溶液对大肠杆菌的抑制作用增强;分子量小于5000的壳聚糖在2.5g/L的浓度下即可显著抑制细菌的生长;而对G+菌——金黄色葡萄球菌，随着分子量的减小，壳聚糖的抗菌作用逐渐减弱。Helander等[18]研究了壳聚糖对几种Gˉ菌细胞外膜阻隔性能的影响，认为壳聚糖与细胞外膜结合，导致细胞外膜阻隔性能降低，是壳聚糖具有抑菌能力的主要原因。

　　2.3壳聚糖是一种增效剂

　　壳聚糖通过所带正电荷增加了与细胞的结合能力，通过与细胞膜的相互作用导致紧密结合的膜蛋白结构的重构，这样既增加了药物的黏附性，又使药物通过细胞旁路途径而增加了其转运[19]，因此可用作药物的增效剂，提高药物的生物利用度。Felt等[20]将壳聚糖和氧氟沙星制成眼液可以增加抗生素的生物利用度，延长泪液中药物作用时间。Senels等[21]和Genta等[5]分别进行了壳聚糖与抗真菌药物(葡萄糖酸氯己定)和抗病毒药物(无环鸟苷)复合物的相关研究，发现均提高了实验药物的生物利用度，前者与葡萄糖酸氯己定复合成膜和凝胶后，在口腔释放可持续3h，当含1g/L的葡萄糖酸氯与壳聚糖复合时有最高的抗真菌活性;后者的无环鸟苷滴眼液在实验兔眼中明显延长了无环鸟苷的药物作用时间，而对兔眼无刺激性。Cao等[22]利用微量渗析法研究了马来酸噻吗心安的多聚异丙基丙基酰胺壳聚糖[poly (Nisopropyl acrylamide)chitosan，PNIPAAmCS]凝胶溶液的降眼压效果，结果显示其在房水中的峰值浓度是普通眼液的2倍，在12h内比传统的同浓度的眼液具有更强的降眼压作用;MTT法分析也显示浓度为0.5～400mg/L的PNIPAAmCS无细胞毒性。

　　2.4止血作用

　　实验证明，甲壳素和壳聚糖都有止血特性，止血功能和效果与它的物理形式、分子量、脱乙酰度和质子化程度等有关。它们可以黏附聚集红细胞和血小板，通过血小板的活化激活凝血途径，加速血纤维蛋白单体的聚合，刺激血管收缩，最终缝合伤口。但壳聚糖对红细胞的聚集作用弱于甲壳素，而对补体系统的活化程度较大。Brandenberg等[23]将甲壳素作为一种新的局部毛细血管渗血止血药用于切除脑皮质的猫脑内，经大体标本和组织学观察证明，它是一种具有良好生物相容性的局部止血剂。目前，通过美国FDA认证的部分甲壳素基止血材料有Syvek纱布、RDH绷带和HemCon止血敷料。

　　2.5抗眼组织纤维化

　　壳聚糖具有选择性抑制纤维细胞生长增生的特性，已被广泛用于预防外科术后组织黏连和抗瘢痕形成。郭晟等[24]将20g/L壳聚糖凝胶用于兔眼眶壁缺损模型观察壳聚糖对眼眶组织黏连的效果，结果显示壳聚糖能减轻眼眶术后组织黏连,无明显不良反应。陆放等[25]对兔青光眼滤过术后结膜下注射壳聚糖溶液，发现实验组术后10～20d仅出现少量纤维细胞增生，并且形成的胶原纤维排列疏松，不规则，结膜下见微囊泡，眼压长期维持在较低水平，与对照组相比有显著性差异(P<0.01)，结果提示壳聚糖可有效抑制成纤维细胞的增生，维持滤过道通畅，可用于青光眼手术。随着对壳聚糖抗瘢痕机制的进一步研究，可望用于治疗其他眼组织纤维化疾病，如增生性玻璃体视网膜病变(PVR)、外伤性牵引性视网膜脱离等。

　　2.6辅助免疫和抗肿瘤作用

　　大量研究证实壳聚糖具有一定的抗肿瘤活性, 并广泛应用于抗肿瘤药物的研究中，但其具体作用机制尚不清楚，可能通过提高免疫功能、抑制糖酵解、活化caspase3诱导癌细胞凋亡等机制而发挥抑癌作用[26,27]。壳聚糖增强免疫和抗肿瘤的机制可能是：(1)壳聚糖为阳性趋化剂,吸附单核细胞从血管中游出, 聚集在组织中形成巨噬细胞;(2)壳聚糖可吸附H+，从而带有大量的NH3+,使其亲和性增强,可以活化巨噬细胞,并能提高NK细胞活性,增加杀伤癌细胞的能力;(3)壳聚糖可活化T细胞，促使其释放出各种淋巴因子;(4)壳聚糖表面的正电荷与肿瘤表面负电荷中和,直接抑制癌细胞的活性。

　　2.7促进伤口愈合

　　Conti等[28]通过喷雾干燥法制备了粉末状的空白和包载氨苄青霉素的壳聚糖纳米微粒，并观察二者对大鼠局部伤口的疗效，发现其均有促进伤口愈合的作用。

　　2.8其他

　　壳聚糖作为药物赋形剂，还有抗酸、抗溃疡、降血脂和降胆固醇等多种作用。经化学修饰可以改进壳聚糖的某些特性，如三甲基壳聚糖(NTrimethyl chitosan chloride)，既保留了壳聚糖的优点，又能通过打开黏膜上皮细胞间的紧密连接而有效地增加亲水性高分子药物的黏膜穿透性[29]，因而具备了更广泛的用途。

　　3壳聚糖纳米给药系统的缓释特性

　　壳聚糖表面带有多价阳离子，能与不同类型的二价和多价阴离子相互作用形成凝胶，制备成纳米状态用于给药系统[3]。与一般纳米载药微粒相同，壳聚糖纳米微粒同样具有缓释、靶向和提高药物稳定性等优越性。壳聚糖纳米系统属于亲水凝胶骨架缓/控释系统，它的亲水性使其在酸性条件下(pH<5)发生溶胀形成凝胶，壳聚糖的亲水能力是控制药物释放的主要因素。药物释放特性还受微球制备方法和工艺条件控制，如浓度、壳聚糖/药物(重量比)、搅拌速率、佐剂的浓度和性质等[3]。体外释放还取决于溶解媒介的pH值、极性和酶的浓度[3]。Jameela等[30]的研究已经证实，药物的缓释程度与缓释时间的平方根有较好的相关性，药物通过壳聚糖微球基质的扩散过程实现了其缓释效应，且药物释放符合Higuchi方程[31]。药物释放过程包括微粒表面及浅层的药物释放、穿过溶胀基质的内部药物渗透、以及聚合物降解时的药物释放[3,30]，即微粒遇水后，表面吸附和浅层包被的药物即时溶解形成早期的首次突释，后经水合作用透明的多聚物微粒溶胀变成胶样基质，在释药系统周围形成一层稠厚的凝胶屏障，此时药物通过扩散作用穿过凝胶屏障而释放，释放速度因凝胶屏障的作用而被延缓，实现了缓释目的。Helw等[32]观察到壳聚糖载药纳米微粒有较高的初始缓释效应，在用药后第1h内约有20%～30%的药物释放。依此特性可制成缓释微球与微囊、缓释片、缓释颗粒和缓释小丸等。

　　不同类型的聚合物材料作为药物载体各有其特点，许多研究者根据需要对载体材料进行了修饰或复合，取长补短实现优势互补，尽可能得到符合实际需要的理想的药物载体。Wu等[33]制备出了壳聚糖磷酸甘油水凝胶(HTCC/GP)载体系统，具有如下特性：(1)对温度和pH值具有敏感性，易与活细胞、蛋白、酶或其他治疗药物结合;(2)在酸性条件下水凝胶溶解，药物释放快，在中性或碱性条件下释药速度因吸水而变慢;(3)透明，可注射，是一种新型的眼部药物递送的智能化载体。Krauland等[34]通过离子凝聚法制备了壳聚糖β环糊精纳米微粒，径粒大小约231～383nm，分别包载了胰岛素和肝素，载药量分别为85.5%～93.3%和69.3%～70.6%，径粒大小也增加为366～613nm，而表面电位无变化;药物体外释放研究显示，胰岛素释放(15min内释放84%～97%)较肝素释放(8h内释放8.3%～9.1%)快，药物释放依赖于药物分子的大小及其与纳米基质的相互作用。Mi等[35]制备了Chitin/PLGA(50/50)微球，包载苯丁酸氮芥体外呈两相释放，慢相药物释放可持续几天以上，提示具有药物载体的应用前景。

　　4壳聚糖纳米给药系统在眼科学研究中的应用

　　纳米粒与药物之间的结合，取决于药物本身的理化性质、所采用的聚合材料以及制备工艺。对各因素进行优化后，制得的以微球或纳米粒为载体的眼用给药系统与传统的给药方式相比，可显著增加药物在眼部的生物利用度。纳米状态的壳聚糖给药系统在眼科学中的研究目前多见于眼表给药。De Campos等[36]通过离子凝胶化法制备出了荧光壳聚糖纳米微粒(CSfl)，在体外测定了其稳定性和对细胞培养的毒性;在兔活体内测定了与兔角结膜细胞的相容性，结果显示：壳聚糖纳米微粒对眼部组织和体外细胞培养无毒性作用，不影响细胞活力;与对照组CSfl溶液相比，纳米微粒在眼表的存留时间延长，并可以渗入到角结膜上皮细胞内，有用于眼部给药载体的潜力。该研究组用相同方法制备了载有免疫抑制剂——环孢霉素(CsA)的壳聚糖纳米微粒，结果显示其在兔眼眼表的有效治疗浓度至少可达48h，而在内眼结构(如虹膜、房水和睫状体)和血液中的CsA水平极低或测不到。这样既延长了CsA在眼表(角结膜)的滞留时间，又避免了眼部(如角膜上皮缺损)和肝、肾和造血系统等全身性的毒副作用[37,38]。Diebold等[39]制备了壳聚糖脂质体纳米微粒(LCSNP)，评估了其对兔眼结膜上皮细胞的毒性作用，结果显示：在体外它对结膜上皮细胞的毒性很低，细胞内的分布形式取决于LCSNP的组成;对实验兔眼行荧光显微镜检查，结膜上皮细胞对LCSNP的吸收多于角膜上皮细胞，且对眼部无刺激性。Enríquez等[40]研究了载有荧光素牛血清蛋白的壳聚糖纳米微粒(CSNPs)和人眼表上皮细胞在体外的相互作用，结果显示实验组的细胞存活率和增生能力与对照组无显著差异;实验组兔眼无炎症反应，荧光显微镜证实CSNPs通过主动转运机制进入兔眼表细胞，且与眼组织相容性好。而且，壳聚糖化学性质稳定，与角膜和房水具有相同的渗透压，并有良好的光学性能，不妨碍视力[41,42]。吕瑞勤等[43]制备了载有阿昔洛韦的壳聚糖纳米粒，平均径粒235nm，平均载药量为1.9%，观察了其体外药物释放过程，通过兔眼结膜囊给药测定药物动力学，观察了药物的生物利用度，结果显示：壳聚糖纳米粒促进了阿昔洛韦的眼部吸收，较市售滴眼液有更高的生物利用度。大量研究表明带正电荷的微粒在眼部组织的吸收显著高于带负电荷的。Motwani等[44]通过改良的乳剂扩散法设计制备了载有喹诺酮类抗菌药——加替沙星的PLGAPVACS纳米粒，径粒范围在318～556nm之间，CS包裹于PLGA表面，CS所携带的正电荷可以和眼内组织结构的负电荷相互作用，通过渗透穿过角膜上皮细胞将药物带入眼内，增加了眼内药物浓度。另外，相关研究表明，纳米粒在角膜炎症组织呈现更理想的黏附特性，有利于今后将药物设计成靶向于眼部炎症区域的给药系统。

　　5小结

　　方兴未艾的纳米技术提供了治疗眼科疾病的理想给药途径，它既可消除眼部特殊生理屏障对药物作用的阻碍，并可携带多种药物，同时也可减少给药次数及药物剂量，减少药物的毒副作用。而壳聚糖所具有的其他一般可降解药物载体所不能比拟的多种生物学特性，进一步丰富了药物载体的作用，摆脱了其他载体材料单一的用于控/缓释载体的局限性，使载体在实现载药的同时或之后也能发挥其本身所具有的一定作用。壳聚糖作为一种特殊的医用材料，已用于制备角膜接触镜片、隐形眼镜清洗液、人工泪液、医用黏弹剂、眼药膏或滴眼液载体或增稠剂、抗纤维增生药物等方面。目前，壳聚糖在眼部给药中的研究多集中于局部点眼或局部包埋治疗眼前节疾病，如干眼、炎症、青光眼和角膜移植术后等，而对于眼后节疾病应用研究较少。未来可通过选用不同脱乙酰度或相对分子质量的壳聚糖，制备适用于治疗眼后节疾病的理想的纳米药物载体，以实现眼后节疾病药物缓释治疗的目的。经化学修饰后的壳聚糖衍生物的理化特性更接近实际需要，扩展了其应用范围。但与传统材料不同，纳米生物材料的径粒大小、径粒分布或表面特性等一旦发生变化，都要对其安全性重新进行评价。

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