小鼠视网膜急性谷氨酸损伤后囊泡膜与质膜谷氨酸转运体的表达

　　作者：李悦,魏锐利　　作者单位：200003)中国上海市，第二军医大学附属长征医院眼科

　　【摘要】目的：探讨不同类型囊泡膜和质膜谷氨酸转运体在小鼠视网膜急性损伤后的表达变化及其可能性作用。 方法：C57BL/6小鼠78只，随机分为3组：正常对照组6只，实验对照组36只(玻璃体内注射生理盐水)，实验组36只(玻璃体内注射谷氨酸)。分别于注射后0.5，3，6，12，24，72h各处死6只，其中3只鼠的眼球用于冰冻切片，以免疫细胞化学法检测各时间点视网膜内Ⅰ型和Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体(VGluT1和VGluT2)及3种质膜谷氨酸转运体：谷氨酸/天门冬氨酸转运体(glutamate/aspartate transporter,GLAST)、谷氨酸转运体1(glutamate transporter1,GLT1)及兴奋性谷氨酸转运体1(excitatory amino acid transporter1,EAAC1)的表达情况。另外3只鼠的眼球用于RNA抽提，以半定量RTPCR检测各谷氨酸转运体mRNA的水平变化。结果：与实验对照组相比，实验组小鼠视网膜兴奋性损伤12h内，VGluT1和VGluT2的表达水平和分布情况均未看到明显变化;24～72h，虽然VGluT1的表达仍未发生改变，但VGluT2却明显地减少。GLAST，GLT1及EAAC1的表达在谷氨酸损伤3～12h均有明显增高，但在24～72h它们的表达水平开始逐渐降低。半定量RTPCR结果与免疫细胞化学结果一致。结论：视网膜急性损伤12h内囊泡膜谷氨酸转运体表达没有发生变化，而质膜谷氨酸转运体表达明显升高。

　　【关键词】 囊泡膜谷氨酸转运体 质膜谷氨酸转运体 谷氨酸兴奋性损伤 视网膜

　　Expression of vesicular and plasma membrane glutamate transporters in the glutamateinduced mouse retina

　　Yue Li, RuiLi Wei

　　Department of Ophthalmology, Changzheng Hospital Affiliated to the Second Military Medical University, Shanghai 200003, China

　　AbstractAIM: To investigate the expression and possible functions of different types of vesicular and plasma membrane glutamate transporters in the mouse retina following glutamate excitotoxicity.METHODS: Seventyeight C57BL/6 mice were divided into 3 groups randomly: Normal control group had 6 mice; Experimental control group included 36 mice that were treated with saline by intravitreal injection; Experimental group had 36 mice that were treated with glutamate by intravitreal injection. Six mice of each group were sacrificed at 0.5, 3, 6, 12, 24, 72 hours respectively. Changes of expression of vesicular glutamate transporter 1 and 2 (VGluT1 and VGluT2) and plasma membrane glutamate transporters: glutamate/aspartate transporter (GLAST), glutamate transporter1 (GLT1) and excitatory amino acid transporter1 (EAAC1) were determined by immunocytochemistry. Semiquantitative RTPCR was also used to detect the changes of mRNA of these transporters.RESULTS: In comparison with experimental control group, the expressional levels and distribution patterns of VGluT1 and VGluT2 were unaltered until 12 hours after glutamate excitotoxicity in experimental group. During 2472 hours, VGluT1 expression was still unchanged while VGluT2 immunoreactivity significantly reduced likely due to delayed retinal ganglion cell death. GLAST, GLT1 and EAAC1 immunoreactivities were enhanced during 312 hours after glutamate induction. However, their expression began to reduce at 24 hours after glutamate excitatory injury. The results of semiquantitative RTPCR were consistent with those of immunocytochemistry.CONCLUSION: Expression of vesicular glutamate transporters is unchanged, but that of plasma membrane glutamate transporters is significantly enhanced within 12 hours in the mouse retina following glutamate excitotoxicity.

　　KEYWORDS: vesicular glutamate transporters; plasma membrane glutamate transporters; glutamate excitotoxicity; retina

　　0　引言

　　谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统内主要的兴奋性神经递质。然而突触间谷氨酸过量积聚则会引发谷氨酸兴奋毒性，造成神经元的损伤甚至死亡。多项研究证明，谷氨酸兴奋毒性是多种神经退行性疾病中神经元死亡的重要原因，亦是视神经受压迫、挫伤、切断及缺血损伤[1]、视网膜缺氧缺血、糖尿病视网膜病变[2]及视网膜变性等视网膜神经元损伤及死亡的主要机制之一。因此，维持突触间谷氨酸浓度的动态平衡是机体自我保护的一种重要机制。哺乳动物中枢神经系统内有两类谷氨酸转运体系统调节着突触间谷氨酸的浓度。一种是囊泡膜谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporter, VGluT)，包括VGluT1，VGluT2和VGluT3，它们可将轴突终末内的谷氨酸装载到突触囊泡内，当神经冲动到达时将谷氨酸释放到突触间隙[3，4]。另一种是质膜谷氨酸转运体，包括谷氨酸/天门冬氨酸转运体(glutamate/aspartate transporter, GLAST)、谷氨酸转运体1(glutamate transporter1, GLT1)、兴奋性谷氨酸转运体1(excitatory amino acid carrier1, EAAC1)，兴奋性谷氨酸转运体4(excitatory amino acid transporter1, EAAT4)和兴奋性谷氨酸转运体5(excitatory amino acid transporter5, EAAT5)，它们可重新摄取释放到突触间隙中的谷氨酸[5]。我们检测谷氨酸损伤后，小鼠视网膜内VGluT1，VGluT2，GLAST，GLT1及EAAC1表达的变化，以明确在急性损伤期是何种转运体参与稳定突触间的谷氨酸浓度。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　C57 BL/6小鼠78只，体质量25～30g，雌雄不限(中国科学院上海神经科学研究所实验动物中心提供)。随机分为3组：正常对照组6只;实验对照组36只，玻璃体内注射生理盐水;实验组36只，玻璃体内注射谷氨酸。戊巴比妥钠(40mg/kg)ip麻醉动物。麻醉生效后俯卧位固定，5g/L丁卡因滴眼进行眼表面麻醉，用微量注射器经颞侧巩膜刺入玻璃体内。实验对照组小鼠双眼玻璃体内缓慢注射生理盐水1μL，实验组动物玻璃体内缓慢注射生理盐水溶解的谷氨酸(375mmol/L, Sigma公司)1μL。洁霉素眼药水滴眼预防感染。分别于注射后0.5，3，6，12，24，72h各处死6只动物，摘除眼球。其中3只鼠的眼球用于免疫细胞化学检测，另3只鼠的眼球用于半定量RTPCR检测。

　　1.2　方法

　　1.2.1　免疫细胞化学检测 摘除眼球于40g/L多聚甲醛(pH 7.4)固定过夜，入200g/L蔗糖至沉底。连续矢状冰冻切片，片厚14μm。切片经0.01mol/L PBS漂洗3次，50mL/L正常山羊血清封闭后，加入10g/LBSA稀释的第一抗体：豚鼠抗VGluT1(1∶5000, Chemicon公司)、豚鼠抗VGluT2(1∶2500,Chemicon公司)、小鼠抗SVP38(1∶200,Sigma公司)，豚鼠抗GLAST(1∶4000, Chemicon公司)、豚鼠抗GLT1(1∶4000, Chemicon公司)及山羊抗EAAC1(1∶1000, Chemicon公司)，4℃反应过夜。加入生物素结合的抗豚鼠IgG(1∶300, Vector Lab公司)，生物素结合的抗山羊IgG(1∶300, Vector Lab公司)或Cy3结合的抗小鼠IgG(1:300, Jackson Lab公司)，室温反应2h。加入Cy2结合的卵白素(1∶1000, Jackson Lab公司)室温反应1h。750mL/L甘油封片后在Nikon 80i荧光显微镜下观察并摄片。利用ImagePro Plus 5.1图像分析软件测定不同时间点各组小鼠视网膜内VGIuT1，VGluT2，GLAST，GLT1及EAAC1免疫阳性反应物的平均荧光强度，取其与正常对照组荧光强度的比值的百分数进行统计学分析。cDNA的RTPCR引物序列

　　1.2.2　半定量RTPCR检测

　　完整剥离视网膜并迅速放入液氮，利用RNA抽提Trizol试剂(Invitrogen公司)一步法提取小鼠视网膜总RNA。1μg RNA用于RTPCR过程，以检测不同时间点各组VGIuT1，VGluT2，GLAST，GLT1及EAAC1的mRNA水平。cDNA的PCR引物序列见表1，GAPDH为内参照。扩增体系：第一链cDNA模板1μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，上下游引物(20μmol/L)各0.5μL，10×La缓冲液2.5μL，La Taq酶0.25μL(Takara公司)，补ddH2O至25μL扩增体系。反应条件均为94℃变性30s，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环数为28，以保证反应在指数上升期。PCR产物于15g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭显色后在凝胶成像分析仪中扫描，并测定电泳条带的灰度值，取其与对应GAPDH的灰度值比值进行统计学分析。

　　统计学分析：所有数据采用( ±s)表示，组间差异进行单因素方差分析(oneway ANOVA)和LSD检验，P<0.05为有显著性差异。所有统计分析均在SPSS 11.5软件中进行。

　　2　结果

　　2.1　囊泡膜谷氨酸转运体的表达

　　正常对照组中，VGIuT1免疫阳性反应物分布于小鼠视网膜的外丛层和内丛层，与突触囊泡蛋白SVP38(Synaptophysin，神经元轴突终末内囊泡的标记物)有完全的荧光双重标记，说明VGIuT1主要分布于感光细胞、双极细胞等的轴突终末内的囊泡上。相反，VGluT2则主要表达在视网膜神经节细胞层中的部分细胞内，这部分细胞主要为神经节细胞。另外，VGluT2还在外丛层中有散在表达，部分与SVP38有双重标记。各时间点VGIuT1和VGluT2在实验对照组(玻璃体注射生理盐水)中的表达与正常对照组没有区别。实验组小鼠视网膜谷氨酸急性损伤12h内，VGIuT1和VGluT2免疫荧光染色的强度和分布与实验对照组相比均未发生明显变化。24～72h，尽管视网膜的厚度明显地变薄，但是VGIuT1免疫荧光染色的强度仍然没有改变。相反，此时VGIuT2的荧光强度减弱，且较实验对照组有明显差异(24h, P=0.034; 72h, P=0.000)，这可能是由于视网膜神经节细胞大量死亡造成的。

　　2.2　质膜谷氨酸转运体的表达

　　正常小鼠视网膜中，GLAST的免疫阳性染色贯穿视网膜全层，包括外丛层和内丛层、内界膜和外界膜，内外核层中亦有放射状的阳性反应物。这些着色的特点提示GLAST主要表达在Müller细胞上。GLT1免疫阳性反应物主要见于内核层和外核层，在外丛层、内丛层和神经节细胞层亦有少量表达)。EAAC1免疫阳性反应物主要分布于外丛层、内丛层和神经节细胞层，在内丛层和内核层交界处亦有部分细胞的着色)。在实验对照组中，各时间点3种质膜谷氨酸转运体表达与正常视网膜没有区别(小鼠视网膜VGIuT1，VGluT2，GLAST，GLT1及EAAC1 mRNA的表达相对灰度值

　　2.3　RTPCR结果

　　与对照组相比，实验组VGIuT1 mRNA水平在所有时间点均无显著改变(表2)。VGIuT2 mRNA表达虽然在0.5 ～12 h亦无显著改变，但在24 ～72 h表达下降，与对照组相比有显著差异(24, 72h,P=0.000)。GLAST和GLT1的mRNA水平在损伤后0.5h有明显的增高(GLAST, P=0.031; GLT1,P=0.026)，并持续到12h(3h, GLAST, P=0.020; GLT1,P=0.016;6, 12h，P=0.000)，但是24h以后mRNA水平发生明显地下降并低于实验对照组(24, 72h,P=0.000)。EAAC1 mRNA水平在0.5h较实验对照组无明显变化(P=0.058)，3～12h mRNA表达显著增加(3h,P=0.014; 6, 12h，P=0.000)，但24h后mRNA水平开始明显下降。

　　3　讨论

　　视神经受压迫、挫伤、切断及缺血损伤[1]、视网膜缺氧缺血等视网膜病理状态下，神经元中ATP含量减少引起Na+泵活性下降，引起大量Na+，C1内流(引起细胞肿胀)和K+外流(使细胞去极化)，细胞去极化会造成谷氨酸过量释放。突触间过高浓度谷氨酸引起的兴奋毒性是多种视网膜疾病中神经细胞损伤的主要机制之一[1，2]。除了突触前神经元过度释放谷氨酸外，谷氨酸清除障碍也是造成突触间谷氨酸浓度过高的重要原因。因此在急性损伤期，及时有效地降低过高的谷氨酸是机体自我保护的重要机制。囊泡膜和质膜谷氨酸转运体是调节突触间谷氨酸浓度动态平衡的两种重要机制。生理状态下，分布于突触前成分内的囊泡膜谷氨酸转运体(VGluT13)可将谷氨酸转运入突触囊泡中，当神经兴奋到来时突触囊泡靠近并与突触前膜融合，将谷氨酸以胞吐形式释放到突触间隙中。因此，囊泡膜谷氨酸转运体控制着突触前膜向突触间隙释放谷氨酸的多少[3，4]。相反，质膜谷氨酸转运体(GLAST，GLT1，EAAC1，EAAT4和EAAT5)可以重新摄取突触间隙的谷氨酸到突触前膜内，作为递质再次被利用，谷氨酸或为胶质细胞摄取并在其中被分解代谢[5]。

　　我们设想，当视网膜内谷氨酸浓度急剧增加时，为了稳定突触间谷氨酸的浓度，机体会反应性抑制囊泡膜谷氨酸转运体的功能，以控制谷氨酸的释放，同时会增强质膜谷氨酸转运体，以促进谷氨酸的清除。我们观察到，VGluT1表达在小鼠视网膜的外丛层感光细胞和内丛层双极细胞轴突终末的突触囊泡上;VGluT2表达在视网膜神经节细胞的胞质和外丛层中部分感光细胞的视锥细胞足(cone pedicles)内;GLAST表达在Müller细胞中;GLT1表达在内、外核层中的双极细胞和感光细胞的胞体和突起上;EAAC1分布于神经节细胞层和内核层中的部分中间神经元，如无长突细胞上。这些结果均与以往报道一致[6，7]。但是出乎我们预料的是，当小鼠视网膜急性谷氨酸损伤12h内，囊泡膜谷氨酸转运体VGluT1和VGluT2的蛋白表达和mRNA水平与实验对照组相比并没有减少，而是基本保持不变。VGluT1的这种表达模式一直可持续到72h，而VGluT2在24h后表达降低，原因可能是由于视网膜神经节细胞的大量死亡。相反，质膜谷氨酸转运体GLAST，GLT1和EAAC1和我们料想一致。在谷氨酸作用12h内，它们的蛋白表达和mRNA水平均较实验对照组有明显地增加。有研究人员利用反意寡核苷酸技术阻断GLAST和GLT1，结果发现大鼠视网膜玻璃体内的谷氨酸浓度和死亡的视网膜神经节细胞都明显增加[8]。这说明质膜谷氨酸转运体对视网膜损伤后谷氨酸的清除发挥着重要的作用。此外，我们还观察到，玻璃体内注射谷氨酸24～72h后，视网膜各层的厚度均明显变薄，而非我们预想的内层(神经节细胞层、内丛层、内核层)损伤重，外层(外丛层、外核层)损伤轻。我们推测可能是外源性谷氨酸可迅速通过细胞间隙作用于视网膜的各层细胞，造成早期各类型谷氨酸转运体的表达增高。损伤后期由于谷氨酸转运体不足以清除持续增高的谷氨酸，从而导致视网膜各层均有大量细胞死亡，视网膜厚度变薄，各类型谷氨酸转运体的表达亦显著降低。因此，在损伤的早期和晚期谷氨酸转运体在各层的表达都是均一的。综上所述，本实验结果提示，视网膜急性损伤后机体可能只加强质膜谷氨酸转运体的功能，从而提高对谷氨酸的清除。但是不改变囊泡谷氨酸转运体的表达，即对囊泡释放的谷氨酸没有影响。然而我们并不能排除，囊泡膜谷氨酸转运体表达水平虽然不变，但是功能却减弱的可能性，因为有文献报道谷氨酸是囊泡膜谷氨酸转运体的一种潜在抑制剂[9]，所以这点仍需我们进一步证明。

　　此外，我们还发现，在兴奋性损伤24h后GLAST，GLT1和EAAC1的水平均较实验对照组有明显降低。以往研究亦发现，当实验性视神经切断或受压缺血后，质膜谷氨酸转运体的表达都会有显著的下调[10]。所以，GLAST等转运体表达及功能的降低，很可能是视网膜病变后期谷氨酸浓度持续升高的重要原因。因此，设法有效地上调伤后质膜谷氨酸转运体的表达，会对减少视网膜神经节细胞死亡和维持视网膜正常功能起到积极的作用。有研究证明，在体外星型胶质细胞培养实验中，胶质细胞源性神经营养因子(glialderived neurotrophic factor，GDNF)能使GLAST的表达上调，而表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)可同时增加GLAST和GLT1表达[11]。以往针对谷氨酸兴奋毒性的研究侧重于使用谷氨酸受体的抑制剂，如MK801[11，12]，美金刚等[13，14]，而我们的结果提示，视网膜急性损伤后，及时使用质膜谷氨酸转运体激动剂很有可能也起到保护视网膜的目的。

　　综上所述，本研究结果显示，小鼠视网膜急性损伤时，机体可能通过增强质膜谷氨酸转运体的清除功能，但不改变囊泡递质的释放来稳定突触间的谷氨酸浓度。因此，尽早地在视网膜急性损伤期使用质膜谷氨酸转运体的激动剂如GDNF，EGF等，很有可能起到减少视网膜神经节细胞死亡及维护视网膜功能的作用。

　　【参考文献】

　　1 Vorwerk CK, Zurakowski D, McDermott LM, et al. Effects of axonal injury osszsn ganglion cell survival and glutamate homeostasis. Brain Res

　　Bull 2004;62(6):485490

　　2 Bellocchio EE, Reimer RJ, Fremeau Jr RT, et al. Uptake of glutamate into synaptic vesicles by an inorganic phosphate transporter. Science 2000;289(5): 957960

　　3 Bai L, Xu H, Collins JF, et al. Molecular and functional analysis of a novel neuronal vesicular glutamate transporter. J Biol Chem 2001;276(12): 3676436769

　　4 Gras C, Herzog E, Bellenchi GC, et al. A third vesicular glutamate transporter expressed by cholinergic and serotoninergic neurons. J Neurosci 2002;22(3): 54425451

　　5 Wssle H, RegusLeidig H, Haverkamp S. Expression of the vesicular glutamate transporter VGluT2 in a subset of cones of the mouse retina. J

　　Comp Neurol 2006;496(13):544555

　　6 Mimura Y, Mogi K, Kawano M, et al. Differential expression of two distinct vesicular glutamate transporters in the rat retina. Neuroreport 2002;13(2): 19251928

　　7 Sherry DM, Wang MM, Bates J, et al. Expression of vesicular glutamate transporter 1 in the mouse retina reveals temporal ordering in development of rod vs. cone and on vs. off circuits. J Comp Neurol 2003;465(12): 480498

　　8 Vorwerk CK, Naskar R, Schuettauf F, et al. Depression of retinal glutamate transporter function leads to elevated intravitreal glutamate levels and ganglion cell death. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000;41(6): 36153621

　　9 Thompson CM, Davis E, Carrigan CN, et al. Inhibitors of the glutamate vesicular transporter (VGLUT). Curr Med Chem 2005;12(3):20412056

　　10 Martin KR, LevkovitchVerbin H, Valenta D, et al. Retinal glutamate transporter changes in experimental glaucoma and after optic nerve transection in the rat. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002;43(5):22362243

　　11 Zelenaia O, Schlag BD. Epidermal growth factor receptor agonists increase expression of the glutamate transporter GLT1 in astrocytes through pathways dependent on phosphatidylinositol 3kinase and the transcription factor NFκB. Mol Pharmacol 2000;57(7):667678

　　12 Sun Q, Ooi VE, Chan SQ. NmethylDaspartateinduced excitotoxicity in adult rat retina is antagonized by single systemic injection of MK801. Exp Brain Res 2001;138(5):3745

　　13 WoldeMussie E, Yoles E, Schwartz M, et al. Neuroprotective effect of memantine in different retinal injury models in rats. J Glaucoma 2002;1(4):474480

　　14 Guo L, Salt TE, Maass A, et al. Assessment of neuroprotective effects of glutamate modulation on glaucomarelated retinal ganglion cell apoptosis in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci 2006;47(5):626633