TGFβ2玻璃体腔注射对EAU大鼠Foxp3表达的调控作用

　　作者：李雪,胡琦　　作者单位：150001) 中国黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学第一附属医院眼科

　　【摘要】目的：利用RTPCR的方法检测EAU时Lewis大鼠视网膜和葡萄膜Foxp3的mRNA表达情况，探讨EAU时转录因子Foxp3的变化及TGFβ2对其的诱导调控作用，为研究葡萄膜炎的病变机制提供理论支持，为临床治疗葡萄膜炎探索新方向。

　　方法：将IRBP R16多肽注入Lewis大鼠左后足底部制备EAU动物模型。按照随机数字表法将36只Lewis大鼠分为正常对照组、EAU未治疗组和EAU TGFβ2治疗组。TGFβ2治疗组于EAU动物模型制备后第1，4，7，10，13，16，19d给予TGFβ2 10μL(浓度为5mg/L)玻璃体内注射治疗。分别于IRBP免疫后7，10，14，21d处死Lewis大鼠，刮取视网膜和葡萄膜，利用RTPCR法检测Foxp3的表达,所得数据应用SPSS 10.0 统计分析软件进行处理。

　　结果：随着EAU病程的进展，Foxp3的表达逐渐增加，但同正常对照组相比，差异不显著，各时间组之间差异不显著。随着EAU病程的进展，TGFβ2治疗组7dFoxp3的表达增加，同正常对照组和未治疗组相比无显著差异。TGFβ2治疗组10，14，21d Foxp3的表达增加，同正常对照组相比有显著差异(P<0.01)，同TGFβ2未治疗组相比Foxp3的表达增加，差异显著(P<0.05)。

　　结论：探讨Foxp3在EAU疾病过程中的表达变化，为进一步研究Foxp3在EAU中的作用机制提供了理论支持。研究了TGFβ2在EAU病程中对Foxp3的表达调控，发现TGFβ2能够增加Foxp3的表达，从而调控Treg细胞，启动免疫抑制功能，为临床治疗葡萄膜炎开辟新方向。

　　【关键词】 EAU;转化生长因子β2;Foxp3

　　Regulation of TGFβ2 on the expression of Foxp3 in experimental autoimmune uveoretinitis by injected into vitreous cavity

　　Xue Li, Qi Hu

　　Foundation item: Science Foundation of Education Office of Heilongjiang Province, China (No. 11521163)

　　Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China

　　Abstract

　　　AIM: To detect the expression of Foxp3 mRNA in different time during experimental autoimmune uveoretinitis (EAU) and to investigate the regulation of TGFβ2 to Foxp3.

　　　METHODS: EAU was induced in 32 Lewis rats by immunization with Interphotoreceptor retinoidbinding protein (IRBP) R16 (30μg) and complete Freunds adjuvant, and another 4 rats were in the normal control group. Thirtytwo Lewis rats were divided into EAU group and therapeutic group. The rats of therapeutic group were injected into vitreous cavity with TGFβ2 10μL (5mg/L) at the 1st, 4th, 7th , 10th , 13th ,16th and 19th day and sacrificed at 7th , 10th , 14th and 21st day after immunization, respectively. The eyeballs were excised and total RNA was isolated from the retina, uvea and reversetranscribed into cDNA to design the specific primer of Foxp3. Amplification of PCR reactions was conducted. The resulting PCR products were separated by electrophoresis in 2% agarose gels and analyzed by a Pharmacia Biotech Image Master VDS Video Documentation system using image analysis software. The optical intensity of each PCR product was normalized to that of βactin from the same animal and electrophoresed. Data was expressed at the mean normalized values ± standard error of the mean.

　　　RESULTS: During the course of EAU, the expression of Foxp3 increased gradually, but changed less compared to the normal control group and had no significant change among the different time groups. The expression of Foxp3 at 10th, 14th and 21st day of treated group increased significantly compared to the normal control group (P<0.01) and untreated group (P<0.05).

　　　CONCLUSION: It is the first time to find the expression of Foxp3 mRNA in different time during EAU. And It is also the first time to find TGFβ2 can upregulate the synthesis and expression of Foxp3 following EAU and regulate the immune suppression.

　　　KEYWORDS: experimental autoimmune uveoretinitis; transforming growth factorβ2; Foxp3

　　0引言

　　葡萄膜炎的发病机制复杂，是一类T细胞介导的自身反应性疾病，其中自身反应性T细胞的活化是致病的关键，而调节性T细胞(Tregulatory cells，TR细胞或Treg)可以主动抑制自身反应性T细胞的活化与增殖，从而控制了T细胞对自身抗原或异体抗原的过度反应。这一发现不仅引起了免疫基础理论的更新，也为临床上一些免疫性疾病的治疗提供了新的思路[1]。最近的研究表明，转录因子Foxp3特异表达在调节性T细胞上，在调控调节性T细胞的发育和功能上起很重要的作用[2]，目前已认为Foxp3可能是调节性T细胞启动免疫抑制功能的“开关”，而TGFβ、T细胞受体(TCR)都可能通过不同途径影响其表达。因此本研究的目的是探讨EAU时转录因子Foxp3的变化及TGFβ对其的诱导调控作用，为研究葡萄膜炎的病变机制提供理论支持，为临床治疗葡萄膜炎开辟一个新方向。

　　1材料和方法

　　1.1材料 近交系雌性Lewis大鼠36只，6～8wk，体质量150～180g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。Freund完全佐剂(CFA)购自美国Sigma公司，Ex TaqTM、反转录酶(AMV)、RNA酶抑制剂、dNTP混合物等均购自TaKaRa BIOTECH大连宝生物工程公司，Trizol Reagent购自Invitrogen公司。IRBPR16多肽片段的合成：IRBP第1177～1191氨基酸残基(ADGSSWEGVGVVPDV)，即R16多肽片段[3]，由上海生工生物技术有限公司合成，纯度为95.6%。

　　1.2方法

　　1.2.1实验分组 按照随机数字表法分为正常对照组4只、EAU未治疗组16只、EAU TGFβ2治疗组16只。TGFβ2治疗组于EAU动物模型制备后第1，4，7，10，13，16，19d给予TGFβ2 10μL(浓度为5mg/L)玻璃体内注射治疗。EAU未治疗组和EAU TGFβ2治疗组再根据IRBP免疫后7，10，14，21d分为4组，每组4只。

　　1.2.2 Lewis大鼠EAU动物模型的建立 Lewis大鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，将IRBPR16多肽30μg+CFA总体积为0.1mL充分研磨成乳剂，注入大鼠左后足底部。

　　1.2.3 TGFβ2玻璃体内注射 在手术显微镜下用微量注射器透过结膜在鼻上或颞上象限距角膜缘后2mm、以40°～60°朝向赤道区刺入玻璃体腔，注入TGFβ2或PBS 10μL。

　　1.2.4标本采集 分别于IRBP注射后7,10,14,21d处死Lewis大鼠，无菌条件下于视神经根部摘除眼球，用无菌手术刀剖开，去除晶状体和玻璃体，刮取视网膜和葡萄膜，置于DEPC处理的研磨离心管中，标明组别和编号，于70℃保存。

　　1.2.5 RTPCR法检测Foxp3的表达 根据已发表的文献[4,5]和Gene Bank的基因序列设计引物，Foxp3(218bp)：5’GCTTGTTTGCTGTGCGGAGAC3’，5’GTTTCTGAAGTAGGCGAACAT3’和βactin(212bp)5’TGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCTG3’，5’GTGCCGCCAGACAGCACTGTGTTG3’，引物均由TaKaRa BIOTECH大连宝生物工程公司合成。每一组样品进行PCR反应时，用βactin作为内参照，用同一样品的cDNA和同样的PCR反应条件进行扩增。琼脂糖电泳。凝胶扫描仪扫描凝胶。分析结果：利用ImageMasterTM VDS Software ( Pharmacia Biotech )软件，根据DNA条带的光密度值确定DNA含量。结果以粘附分子OD/βactin OD β标准差来表示。

　　统计学处理：所得数据应用SPSS 10.0统计分析软件进行处理，统计学方法采用配对样品T检验(T检验)和单因素方差分析(F检验)。

　　2结果

　　2.1 EAU时视网膜Foxp3的表达变化 随着EAU病程的进展，Foxp3的表达逐渐增加，但同正常对照组相比，差异不显著，各时间组之间差异不显著。

　　2.2 TGFβ2治疗组对视网膜Foxp3表达的诱导调控 随着EAU病程的进展，TGFβ2治疗组7d Foxp3的表达增加，同正常对照组和未治疗组相比无显著差异。TGFβ2治疗组10，14，21d Foxp3的表达增加，同正常对照组相比有显著差异(P<0.01)，同TGFβ2未治疗组相比有显著差异。

　　3讨论

　　葡萄膜炎是一种常见的累及葡萄膜、视网膜、视网膜血管及玻璃体的炎症性眼科疾病，多发生于青壮年，常累及双眼，并可反复发作，产生严重的并发症和后遗症，是常见的致盲眼病之一。葡萄膜炎的发病机制复杂，是一类T细胞介导的自身反应性疾病，其中自身反应性T细胞的活化是致病的关键，目前认为Th1细胞和Th2细胞数量和功能的失衡，特别是Th1细胞的大量激活及相关细胞因子的产生在葡萄膜炎的发生、发展中起着重要作用[6，7]。因此，抑制自身反应性T细胞的活化与表达，寻找Th1细胞和Th2细胞之间的平衡点，成为治疗葡萄膜炎的目标[8]。

　　从20世纪70年代以来，免疫学家们一直争论机体内是否存在着抑制性T细胞。1995年Sakaguchi等[9]发现，将去除了CD+4 CD+25组分的T细胞转移到裸鼠体内会引发多种自身免疫性疾病，而当同时输入CD+4 CD+25T细胞则可抑制疾病的发生，因此提出了调节性T细胞(T regulatory cells，TR细胞或Treg)的现代理论。调节性T细胞指的是一类控制或抑制其它细胞功能的细胞，通常起抑制作用，对于维持机体免疫自稳、防止自身免疫病具有极其重要的作用，是外周免疫耐受的新的重要机制。

　　Foxp3是叉头样转录因子家族中的成员，2001年由Brunkow等[10]首次报道，它的表达及功能与TR细胞密切相关。Khattri等[11]发现，IPEX综合征时Foxp3基因由于发生移码突变，导致编码的蛋白被提前终止，影响了DNA结合域或亮氨酸拉链的合成，因而不能有效发挥Foxp3的生理功能，使TR细胞的发育受到阻碍而导致自身免疫性疾病。Fontenot等[12]发现，高表达Foxp3的转基因小鼠TR细胞数量明显增加，Foxp3敲除小鼠活化的CD+4T细胞增多，却缺乏独立的CD+4 CD+25T细胞，因而导致自身免疫性疾病的发生。Walker等[13]通过转基因技术人为地使 CD+4 CD-25 T细胞表达Foxp3，发现这些转染后的细胞获得了TR细胞表型和功能，该细胞能通过直接触方式抑制效应细胞的增殖试验，并且是TCR依赖性的，这与天然CD+4、 CD+25 T细胞的性质非常相似，同时上述转染的细胞也能够阻止自身免疫性胃炎的发生[14]。以上实验充分表明，Foxp3可调控TR细胞发育及其功能效应，目前已认为Foxp3可能是Treg细胞启动免疫抑制功能的“开关”。在本研究中我们通过RTPCR的方法检测了EAU不同时间组Foxp3的表达，发现随着EAU病程的进展，Foxp3的表达逐渐增加，但同正常对照组相比，差异不显著，各时间组之间差异也不显著。说明在EAU的病理损伤过程中并没有启动Foxp3的调控作用或者发生自身免疫反应(EAU)的机体进行了自我调控，增加了Foxp3的表达，但并不足以抑制EAU的发生。首次证明Foxp3在EAU疾病过程中的表达变化，为进一步研究Foxp3在EAU中的作用机制提供了理论支持。Foxp3表达的调控机制目前尚不清楚。有研究认为，T细胞受体(TCR)、TGFβ都可能通过不同途径影响其表达[1517]。转化生长因子β是一种调节细胞增殖、分化、细胞间质蛋白表达的一类多功能的细胞生长因子，是由112个氨基酸组成的通过二硫键相连的二聚体分子—具有同源双链的25KD多肽。TGFβ有5个亚型，哺乳动物只表达其中3个亚型，即TGFβ1，TGFβ2和TGFβ3。TGFβ由树突状细胞、巨噬细胞、T细胞和NK细胞合成。能够合成TGFβ的T细胞主要是Th3细胞[17]。TGFβ的生物学作用主要有以下几个方面：(1)诱导TR细胞的生成。TGFβ和IL2合用可以促进CD+4 CD+25 T细胞在胸腺内的发育[19]。Fantini等[20]在研究外周CD+4 CD-25 T细胞向调节性T细胞转变的机制时发现，TGFβ能够诱导CD+4 CD-25 T上调表达Foxp3，从而使CD+4 CD-25 T细胞转化为CD+4 CD+25 T细胞，这些Treg细胞抑制自身反应性T细胞的活化，阻止自身免疫应答的发生。上述实验均说明TGFβ能通过某些途径调控Foxp3的表达，在TR细胞的生成中发挥一定作用。在我们的实验研究中，发现经过TGFβ2玻璃体内注射治疗的EAU大鼠Foxp3表达增加，TGFβ2治疗组10，14，21d时Foxp3的表达同TGFβ2未治疗组相比差异显著(P<0.05)。表明TGFβ2玻璃体内注射能够促进Foxp3的表达，而Foxp3可调控TR细胞发育及其功能效应，使CD+4 CD-25 T细胞转化为CD+4 CD+25 T细胞，这些Treg细胞抑制自身反应性T细胞的活化，从而阻止自身免疫应答的发生。

　　　EAU是一种以Th1/Th2细胞功能紊乱为特征的自身免疫性疾病，CD+4 CD+25调节性T细胞可以通过细胞接触依赖机制或抑制性细胞因子依赖机制主动抑制自身免疫T细胞的活化，在EAU的发病机制中起着重要的作用。转录因子Foxp3是CD+4 CD+25调节性T细胞关键调控因子，而TGFβ作为抑制性细胞因子能够影响Foxp3的表达，所以我们考虑利用TGFβ对Foxp3的诱导调控来治疗EAU。通过以上的实验我们证明TGFβ2能促进EAU时Foxp3的表达，在眼局部免疫调节过程中起着重要的作用，在免疫抑制等方面具有重要的临床应用前景，为临床治疗葡萄膜炎开辟了一个新方向。

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　　16 Fontenot JD, Gavin MA, Rudensky AY. Foxp3 programs the development and function of CD+4 CD+25 regulatory T cells. Nat Immunol2003; 4(4):330336

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