自体虹膜色素上皮细胞移植治疗视网膜色素上皮细胞变性研究

　　作者：徐国兴，谢茂松，郭健，郑卫东，何青，林鸿，高珊 作者单位：(350005)中国福建省福州市,福建医科大学附属第一医院 福建省眼科研究所

　　【摘要】 目的：研究自体虹膜色素上皮细胞(iris pigment epithelium，IPE)移植治疗视网膜色素上皮细胞变性的效果。方法：采用酶机械分离酶消化法获取高纯度、高活力的IPE细胞用于移植，采用外路法将IPE细胞悬液移植入视网膜下腔。结果：IPE移植术后患者眼底移植区色素沉着减少，未见渗出，出血,视网膜平,视力入院时的0.15，术后2wk提高至0.2。多焦ERG显示移植区P1波平均反应密度上升。结论：自体虹膜色素上皮细胞移植有望成为视网膜色素上皮细胞变性疾病治疗的一新方法。

　　【关键词】 视网膜色素上皮变性;治疗;虹膜色素上皮;移植

　　Iris pigment epithelium transplantation for treating retinitis pigmentasa

　　GuoXing Xu, MaoSong Xie, Jian Guo, WeiDong Zheng, Qing He, Hong Lin, Shan Gao

　　Foundation item: Science Research Foundation of Major Project of Fujian Province, China (No. 2002Y002)

　　Ophthalmology Research Institution of Fujian Province, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, Fujian Province, China

　　Correspondence to: GuoXing Xu. Ophthalmology Research Institution of Fujian Province, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, Fujian Province, China. zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn

　　AbstractAIM: To investigate the effect of the iris pigment epithelium (IPE) transplantation for treating retinitis pigmentasa (RP).METHODS: RPE with high purity and activity was obtained from enzymemechanical separationenzyme digestion method, and then was transplanted to the subretinal space by extraocular surgery.RESULTS: After operation, chromatosis at transplantation region of fundus decreased, without effusion or hemorrhage. Retina was flat, and the visual acuity was improved to 0.2 at two weeks after operation compared with 0.15 when was admitted to hospital. P1 wave reaction density was increased from multifocus ERG. CONCLUSION: IPE cells transplantation may be a new method in treating RP.

　　KEYWORDS: retinitis pigmentasa; treat; iris pigment epithelium; transplantation

　　引言

　　视网膜色素上皮细胞变性(retinitis pigmentasa，RP)是以进行性感光细胞及色素上皮细胞功能丧失为共同表现的遗传性视网膜变性疾病。估计目前全世界已有患者约150万人，是眼底病致盲的重要原因之一[1]。目前尚缺乏有效的治疗方法来阻止或逆转这些疾病中的视网膜退行性改变。我们于2005年采用自体虹膜色素上皮细胞(iris pigment epithelium，IPE)移植治疗视网膜色素上皮变性,获得较为满意的疗效,现报告如下。

　　1对象和方法

　　1.1对象

　　我院确诊为双眼视网膜色素上皮细胞变性的女患者54岁。vod: 0.25、vos：0.15。双眼视物模糊近50岁，伴夜盲。入院后检查多焦视网膜电图(ERG)、视觉诱发电位(VEP)、彩色眼底照像、OCT检查、裂隙灯和散瞳眼部检查所见:双眼外眼(),晶状体混浊，双眼底视网膜平，弥漫性色素紊乱，散在骨细胞样色素沉着，视乳头色稍苍白，边界清，黄斑区中心凹反光消失，血管变细。荧光血管照影：双眼底背景荧光增强，未见渗漏。视网膜电图(ERG)视觉诱发电位(VEP)：双眼FERG未记录到暗适应、暗适应最大反应的a、b波成分及振荡电位振幅。双眼FERG未记录到明适应反应的a、b波成分。mfERG:右眼各环P1波振幅反应密度值下降，左眼各环P1波振幅反应密度值显著下降。VEP:右眼30Hz反应的P1波振幅显著下降，左眼未记录到P1波振幅。OCT检查：双眼视网膜神经纤维层变薄。双眼管状视野。入院诊断:1双眼视网膜色素变性;2双眼并发性白内障。入院后第3d行左眼超声乳化白内障人工晶状体植入+虹膜色素上皮细胞移植术治疗。

　　1.2方法

　　患者仰卧位，常规消毒铺巾、开睑，上直肌吊线牵引。角膜缘遂道式阶梯板层切口长2.5mm，前房注healon，环形撕前囊(d=6mm),Phaco晶状体核，I/A皮质，植入博士伦折叠PIOL，同部注吸Healon，瞳孔圆，IOL位置好。行上方虹膜根部切除术，切除虹膜大小约3.5mm×3.5mm，切除虹膜组织交与助手制备虹膜色素上皮细胞。在助手制备细胞同时术者继续进行手术操作，颞上方结膜下注入利多卡因麻醉，作上方10点半角膜缘后12cm处平行于角巩缘的结膜切口长约5mm及巩膜切口长约3mm切口，剥离至隐约可见脉络膜。以100进口尼龙线作预置缝线。于切口处以IPE移植专用引导针穿刺入视网膜下腔，用IPE移植专用移植器注入30μL的IPE细胞悬液(50/μL)，结扎巩膜预置缝线，眼底镜直视下确认细胞移植入视网膜下腔，无出血、穿孔。缝合结膜切口。要求术后3d内患者仰卧。眼部应用皮质类固醇、抗生素和非甾体消炎眼液qd，托品卡胺散瞳qd。术后2wk复查视力、裂隙灯检查及检眼底镜、多焦视网膜电图(ERG)、视觉诱发电位(VEP) 等检查。

　　2结果

　　术后2wk检查：左眼结膜充血，切口愈合好，角膜透明，前房中等深，房水清，虹膜周切口可见，瞳孔圆，人工晶状体位置正。诉视物较术前清晰。左眼视力从术前的0.15提高至0.2。多焦ERG显示移植区P1波平均反应密度上升。

　　3讨论

　　视网膜色素上皮细胞变性的典型症状为夜盲伴进行性视野缺损，眼底表现为视乳头蜡黄，视网膜血管变细，视网膜色素上皮斑驳状，骨细胞样色素沉着和视网膜电图异常为其特征。估计目前全世界已有患者约150万人，是眼底病致盲的重要原因之一。目前视网膜色素上皮变性等疾病缺乏有效的药物治疗。视网膜色素上皮细胞变性患者由于自身的视网膜色素上皮细胞变性、功能丧失或减弱，所以自身的视网膜色素上皮细胞不是理想的移植物。寻找可替代RPE细胞功能的细胞是移植的理想供体[24]。IPE细胞由于胚胎来源与RPE细胞相同而倍受关注。近年来自体IPE细胞移植成为RP治疗的研究热点。

　　虹膜色素上皮细胞(iris pigment epithelium，IPE)在解剖学上与RPE具有相同的胚胎发育起源。IPE在形态结构与RPE细胞有很多相似之处。IPE具有许多与RPE相同的生理功能，如屏障功能、吞噬功能等。一定条件下IPE和RPE可以转化为晶状体上皮细胞、神经视网膜细胞等。在视网膜下腔IPE细胞还有可能转化为RPE细胞。因此，人们设想用自体IPE细胞来替代病变的RPE细胞，既达到治疗疾病的目的，又可避免同种异体的免疫排斥反应[58]。本研究发现，自体虹膜色素上皮细胞移植术后2wk，视力比术前略有提高。mfERG的b波振幅只有轻度变化，左眼视力从术前的0.15提高至0.2。多焦ERG显示移植区P1波平均反应密度上升。mfERG检测视杆细胞、视锥细胞和双极细胞的功能，因此它比视力更准确地反应视网膜中心区的功能。本研究采用自体虹膜色素上皮细胞进行移植，这有效地避免了术后免疫排斥反应的发生。IPE细胞存活率一方面与细胞的数量和质量有关，另一方面与存活条件相关。细胞取材方法直接关系到细胞质量和数量，我们采用酶机械分离酶消化法获取色素上皮细胞，采用胰蛋白酶有利于减弱细胞间连接，然后在手术显微镜下用弯的钝头虹膜恢复器直视下轻刮使IPE细胞落入培养液中，这有效地避免长时间酶消化对色素上皮细胞的损伤，提高色素上皮细胞的存活率。由于上皮细胞间的群体效应色素细胞需达到一定数量才能再生融合形成单层结构，Binder等[9]研究体外研究显示老年人色素上皮细胞为再生融合形成单层结构而所需最少的细胞数为1500。本研究发现通过虹膜周边切除后用于分离、提取IPE细胞的虹膜组织的IPE细胞悬液(30μL×50/μL)可以达到这个要求。

　　移植后的IPE细胞粘附至Bruchs膜形成完整的血视网膜屏障功能对移植存活和移植物保持长期功能是至关重要的。本研究采用IPE移植专用的引导针穿刺入视网膜下腔，针头极细，穿刺入视网膜下腔时对脉络膜和视网膜色素上皮层损伤极小;患者移植IPE细胞后仰卧休息有利于IPE沉淀粘附于Brush膜上生长。本研究采用后巩膜外路法则由巩膜经脉络膜抵达视网膜下腔，其优点是不经过玻璃体，对玻璃体及视网膜神经上皮层无损伤，这避免了术后增殖性玻璃体视网膜病变的发生。手术后移植的IPE细胞粘附于Brush膜上生长而使RPE细胞层穿刺孔自闭。实验研究发现IPE细胞具有摄取、储存和代谢维生素A的功能，呑噬色素颗粒，物质转运和形成单层细胞屏障等功能[10,11]。这提示IPE细胞基本具备RPE类似的生理功能，可望成为RPE的替代物，用于自体移植。本研究患者术后视力提高，眼底移植区色素沉着减少，未见渗出，出血，视网膜平复。多焦ERG显示移植区P1波平均反应密度上升。这可能与移植的IPE细胞替代变性的RPE细胞执行RPE细胞生理功能，重建局部微环境，从而改善患者视功能有关。总之，目前对视网膜色素上皮变性等疾病尚无有效的治疗方法，自体虹膜色素上皮细胞移植作为视网膜变性疾病的再生性疗法，为视网膜变性疾病开辟新的治疗途径。

　　【参考文献】

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　　6徐国兴.色素上皮细胞移植治疗视网膜变性疾病:问题与展望.眼科 2007;16(4):229232

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　　9 Binder S, Krebs I, Hilgers RD, et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in agerelated macular degeneration: a prospective trial. Invest Ophthalmol Vis Sci2004;45(11):41514160

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　　11徐国兴,杨娟,孙堂胜.溶血磷脂酸对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响.眼视光学杂志 2004;6(1):3844