老年黄斑变性脉络膜新生血管膜的基质侵袭增生活性

　　作者：李亚萍 王玲 刘早霞 苏冠方 吴雅臻 李玉林 作者单位：(吉林大学第二医院眼科医院,吉林 长春 130041)

　　【摘要】目的 研究老年黄斑变性(AMD)脉络膜新生血管膜(CNVM)的增殖活性。方法 22例AMD病人的CNV膜，用免疫组化的方法分析血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)在CNV膜中的表达。结果 活动期CNV膜与消退期、静止期CNV膜对比，VEGF、MMP2、MMP9均有较高的表达;在静止期CNV膜的 VEGF、MMP2、MMP9无表达或表达较少 (P<0.01)。结论 细胞的基质侵袭力、促细胞增殖活性的VEGF、MMP2、MMP9与CNV膜的病理分期(活动期、消退期、静止期)具有明显的相关性。

　　【关键词】 老年黄斑变性;脉络膜新生血管膜(CNVM);CNVM的增殖活性

　　2004年，李亚萍等根据渗出性AMD的脉络膜吲哚青绿造影(ICGA)与组织病理学特点将脉络膜新生血管膜(CNVM)分为：活动期、消退期、静止期〔1〕。为了进一步探讨血管内皮细胞、色素性细胞、成纤维细胞、和慢性炎性细胞的增殖活性与CNV膜分期的关系，本研究检测血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9在CNV膜中的表达，以上各因子的表达与CNV膜的发生、发展、退化的相关性，并进一步探讨各因子的表达与CNV膜分期的关系。此方面的研究国际上未见报道。

　　1 材料与方法

　　1.1 资料 2001～2008年，我院确诊的渗出型AMD患者22例22只眼，患者年龄54～81岁，平均67.9岁;男16例，女性6例。视力范围：指数/30 cm～0.4。行ICGA检查将CNV分期〔1〕：活动期CNV膜9例;消退期CNV膜9例;静止期CNV膜4例。行玻璃体切割术联合视网膜下CNV膜取出手术。术中获取的CNV膜标本进行病理学检查。

　　1.2 主要试剂 VEGF多克隆抗体、MMP2单克隆抗体、MMP9单克隆抗体、兔抗鼠、羊抗兔二抗、SPAP染色剂、San NBTBCIP显色剂，均为Santa Cruz产品，购自北京中山生物公司。

　　1.3 方法 免疫组织化学方法观察VEGF、MMP2及MMP9表达。判定VEGF、MMP2、MMP9染色阳性标准：胞浆、核膜、基质染成紫蓝色或淡蓝色，为阳性反应细胞。分别选取每张片上的血管内皮细胞、色素细胞、成纤维细胞、和慢性炎性细胞观察，按阳性细胞占每类细胞的比例分3级：未见阳性细胞为(-)，阳性细胞小于25%为(+)，25%～50%为()，大于50%为()。阴性对照用小鼠血清代替Ⅰ抗。

　　1.4 统计学方法 实验所得数据用SAS软件分析，数据处理采用秩和检验。

　　2 结果

　　2.1 VEGF、MMP2、MMP9的表达 活动期CNV与消退期、静止期对比，VEGF、MMP2、MMP9均有较高的表达;在静止期CNV的 VEGF、MMP2、MMP9无表达或表达较少，差异有显著意义(P<0.01)。见表1，图1。

　　表1 VEGF、MMP2、 MMP9在CNV膜中的表达(略)

　　图1 CNV膜VEGF、MMP2的表达(DAB，×200)(略)

　　3 讨论

　　本研究以MMP2、MMP9和VEGF为代表来研究CNV膜的基质侵袭、促细胞增殖活性。

　　VEGF是新生血管生成的启动因素，最直接的眼内新生血管形成因子〔2〕，它可特异地作用血管内皮细胞，而且缺氧可上调其mRNA和蛋白质表达〔3〕。目前研究已证实毛细血管内皮细胞存在VEGF高亲合受体，而且受体数目较其他组织内皮细胞多。VEGF是一种分泌型碱性蛋白，分子量是34～42 kD，是一种自分泌生长因子，视网膜内皮细胞可合成，并且此内皮细胞具有VEGF高亲合受体。VEGF也是一种旁分泌生长因子，上皮细胞和动脉平滑肌细胞、视网膜色素上皮细胞、周皮细胞能产生VEGF，这些VEGF仅结合于血管内皮细胞上。VEGF家族有四个成员，分别含有121，165，189和206个氨基酸。 VEGF起动血管形成的步骤是内皮细胞胶原酶的合成及释放，内皮细胞的迁移和增殖〔4〕。

　　MMP是一组含锌的中性内肽酶，主要作用是降解胶原等细胞外基质(ECM)。MMP以酶原形式从细胞内分泌，经蛋白酶和自身催化作用水解除去氨基末端肽段，或在体外经有机汞(APMP)、佛波脂(PMA)等非蛋白酶裂解和改变分子的构型而被激活。某些生长因子如VEGF、bFGF、IL1等可促进MMP基因的表达，使其合成、分泌增加。其活性可被体内特异的基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)抑制。MMPTIMP的平衡维持着体内ECM合成降解的平衡，因此是维持组织器官正常结构和生理功能的关键。目前已知体内有17种MMP，主要分四类：①胶原酶(MMP1、8、13)，主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原。②明胶酶即Ⅳ胶原酶(MMP2、MMP9)主要降解Ⅳ型胶原和变性的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原等。③基质溶素(MMP3、7、10、11、12)广泛地降解ECM，如蛋白聚糖，纤连蛋白，层黏连蛋白等。④膜型金属蛋白酶(MMP14、15、16、17)。新生血管的形成是以基底膜降解，内皮细胞的增殖、迁移和毛细血管形成的多重步骤过程。已知VEGF和bFGF在内皮细胞的迁移和增殖中起重要作用，但是迁移的微血管内皮细胞必须穿过毛细血管的基底膜，侵入邻近的ECM才能增殖和形成血管组织，因此内皮细胞下基底膜和周围基质的降解是血管形成关键的一步，参与这个降解过程的主要为MMP2、MMP9、尿激酶，因为基底膜的主要成分为Ⅳ胶原，尿激酶是胶原酶的间接激活剂。MMP2可能与αυβ3整合素功能相连，调节着迁移的内皮细胞和下面基质的相互作用，血管内皮细胞对周围基质的侵入取决于细胞的黏附和蛋白水解的协调一致。ECM是组织形成的支架，细胞为其迁移和生存需要特异的基质成分，黏附分子整合素是由α、β两条链非共价键连接构成的异二聚体，位于细胞表面，是ECM的受体，介导着细胞与ECM及细胞与细胞的黏附性。在血管生成中MMP2与内皮细胞表面的αυβ3整合素结合，可在侵入的细胞表面产生一个高的局部蛋白水解活性区，并增加整合素αυβ3配体的产生以促进细胞的黏附、侵入、增殖。所以，MMP2、MMP9在新生血管形成中起着重要的作用。

　　VEGF、MMP2、MMP9位于CNV膜的基质中，因此本研究选择VEGF、MMP2、MMP9代表CNV黏附、侵入、增殖活性的指标。

　　活动期CNV膜与消退期CNV膜、静止期CNV膜对比，VEGF、MMP2、MMP9均有较高的表达，说明CNV膜有较强的侵袭增殖活性;在静止期CNV膜的 VEGF、MMP2、MMP9无表达或表达较少，提示CNV膜无明显的侵袭活性，处于静止状态。

　　代表细胞的基质侵袭力、促细胞增殖活性的VEGF、MMP2、MMP9与CNV膜的病理分期(活动期、消退期、静止期)具有明显的相关性。

　　【参考文献】

　　1 李亚萍，黎晓新，张晓光，等.渗出性老年性黄斑变性脉络膜新生血管的吲哚青绿血管造影与组织病理变化的相关性研究〔J〕.中华眼底病杂志，2004;3;20(2)：6972.

　　2 Elner SG，Elner VM，Jaffe GJ,et al.Cytokines in proliferative diabetic retinopathy and proliferative vitreoretinopathy〔J〕.Curr Eye Res，1995;14 (11)：104553.

　　3 SchmidBrunclik N，BürgiTaboada C，Antoniou X,et al.Astrocyte responses to injury：VEGF simultaneously modulates cell death and proliferation〔J〕.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2008;295(3):R86473.

　　4 Huang Y，Cideciyan AV，Papastergiou GI,et al.Relation of optical coherence tomography to microanatomy in normal and rd chickens〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，1998;39:240516.