2型糖尿病患者结膜上皮细胞中TGFβ1和NFκB的表达

　　作者：李英俊 金龙山 作者单位：延边大学附属医院 眼科，吉林 延吉 133000

　　【摘要】 [目的]观察2型糖尿病患者结膜上皮细胞中转化生长因子β1 (TGFβ1)和核转录因子κB(NFκB)的表达情况.[方法]选择2型糖尿病患者92例和正常人70例，任意选取一眼进行泪膜破裂时间(BUT)、基础泪液分泌试验及角膜荧光染色试验，并应用免疫组织化学方法检测结膜上皮细胞中TGFβ1及NFκB的表达.[结果]糖尿病组患者BUT值小于10s和基础泪液分泌值小于5mm者所占比例较对照组明显升高，角膜荧光染色程度较对照组明显增强.结膜上皮细胞TGFβ1和NFκB的染色程度均较对照组明显增强;糖尿病组患者结膜上皮细胞TGFβ1与NFκB的染色程度呈正相关.[结论]2型糖尿病患者BUT值和基础泪液分泌试验值降低，角膜荧光染色程度增强，是干眼症易患人群.

　　【关键词】 糖尿病 2型 转化生长因子β 干眼症

　　Expression of TGFβ1 and NFκB on conjunctiva endepidermis cells in type 2 diabetes mellitus

　　LI Yingjun， JIN Longshan*

　　(Department of Ophthalmology, Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, Jilin, China)

　　ABSTRACT:OBJECTIVETo study the expression of transforming growth factorβ1(TGFβ1) and nuclear factorκB (NFκB) on conjunctiva endepidermis cells in patients with diabetes mellitus (DM).METHODS92 patients of DM and 70 cases of health adult were randomly selected. One eye in patients was selected to do the tear film breakup time (BUT), Schirmer test and cornea fluorescein staining, and the expression of NFκB and TGFβ1 on bulbar conjunctiva endepidermis was detected by immunohistochemistry.RESULTSThe ratios of BUT value (<10s) and Schirmer value (<5mm) in DM increased significantly as compared with the control group, and the degree of cornea fluorescein staining in DM was higher than that in control group. The staining level of NFκB and TGFβ1 of bulbar conjunctiva endepidermis in DM was higher than that in control group and was positive correlation. CONCLUSIONIn type 2 DM, the value of BUT and Schirmer decrease and the degree of cornea fluorescein staining increase is incident to the xeroma.

　　Key words: diabetes mellitus, type 2; transforming growth factor beta ;xerophthalmia

　　干眼症患者结膜上皮细胞内各种炎性因子的表达水平明显高于正常人，如表皮生长因子、转化生长因子β1 (transforming growth factorβ1，TGFβ1)及核转录因子κB(nuclear factorκB，NFκB)等[1,2].TGFβ1是多功能细胞因子，对上皮细胞具有较明显的抑制作用，对成纤维细胞及其他间叶组织来源的细胞均具有明显的刺激作用，表现为胶原合成增加，有利于组织修复及伤口愈合[3，4].NFκB是具有转录激活功能的蛋白质，几乎存在于所有细胞中,它可调节多种参与炎症反应的细胞因子、黏附分子和蛋白酶类的基因转录过程，与炎症的发生密切相关[5].本研究采用免疫组织化学方法对2型糖尿病患者结膜上皮细胞中TGFβ1和NFκB的表达情况进行了检测，并比较分析了正常人群和2型糖尿病患者的眼表状态.

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验对象 本研究对象2型糖尿病患者和正常健康人共为162人，其中正常对照组为70人(70眼)、2型糖尿病组为92例(92眼)，两组研究对象年龄及性别构成比间无显著性差异,具有可比性.

　　1.1.2 试剂 TGFβ1多克隆抗体，经亲和层析纯化的兔抗人IgG多克隆抗体，稀释度为1∶200;NFκB p65多克隆抗体，经亲和层析纯化的兔抗人IgG多克隆抗体，稀释度为1∶200.SP试剂盒(通用型SP kit)及DAB显色剂均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品;PBS及Mayer苏木素均为福建迈新公司产品.

　　1.1.3 仪器 CMIAS系列真彩色病理图像分析系统为北京航空航天大学产品，RM2135型石蜡切片机为德国产品，CD1型快速生物医学微波炉为上海创大科技有限公司产品.

　　1.2 方法

　　1.2.1 临床检查 BUT重复测定3次，取平均值，BUT值小于10s判定为异常，基础泪液分泌试验以湿润长度小于5mm时判定为异常.角膜荧光素染色评分方法将角膜分为4个象限：0级为无染色(-)，1级为散状点状染色(+)，2级为密集型点状染色()，3级为片状染色().

　　1.2.2 免疫组织化学染色 将乙酸纤维素薄膜剪成3mm×3mm大小纸条，用培养皿包装进行消毒，预备贴有5mm×5mm大小双面胶的载玻片.取材时，嘱患者注视鼻侧，用眼科无齿镊夹住乙酸纤维素薄膜一角轻轻置于患者颞侧球结膜表面，用玻璃棒轻压少许后取出，贴于载玻片上，每个对象至少取2次标本，待薄膜稍干后，用950mL/L乙醇固定5min，置于-80℃超低温冰箱保存备用.进行免疫组织化学染色，检测TGFβ1及NFκB的表达情况.采用过氧化物酶标记的链霉菌抗生物素蛋白行免疫组织化学染色，阴性对照以PBS代替一抗进行，阳性对照为乳腺癌标本.染色结果判定标准：用光学显微镜观察，见细胞膜边界清晰，无特异性细胞膜或胞浆染色者为阴性(-);细胞膜或胞浆有特异性着色，呈浅棕黄色、棕色及深棕色者分别为弱阳性(+)、中度阳性()及强阳性().将表达阴性和弱阳性者纳入阴性组，中度阳性和强阳性者纳入阳性组.

　　1.2.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，两组间BUT 检查、基础泪液分泌试验、角膜荧光素染色比较及糖尿病组TGFβ和NFκB表达相关性分析采用χ2检验进行.TGFβ1和NFκB表达与各项临床检查之间的相关性分析采用Spearman’s检验进行.

　　2 结果

　　2.1 BUT值测定和基础泪液分泌试验 糖尿病组患者BUT值异常者为56眼(60.89%)，基础泪液分泌试验异常者为52眼(56.52%)，均明显多于对照组，相比较均具有显著性差异(P<0.01).

　　2.2 角膜荧光染色检测 对照组人群中角膜荧光染色阳性者为24眼(34.29%)，糖尿病组中为52眼(56.52%)，两组间比较见差异具有统计学意义(P<0.05).

　　2.3 结膜上皮细胞TGFβ1及NFκB的表达 对照组人群结膜上皮细胞TGFβ1染色程度主要为弱阳性(+)，只有25.70%表现为中度阳性()以上，而糖尿病组58.70%患者TGFβ1染色程度在中度阳性()以上，两组间比较具有显著性差异(P<0.01);对照组人群结膜上皮细胞NFκB染色程度主要为弱阳性(+)，40.00%表现为中度阳性()以上，而糖尿病组中76.09%患者NFκB染色程度为中度阳性()以上，相比较具有非常显著性差异(P<0.001).

　　2.4 糖尿病患者结膜上皮细胞TGFβ1与NFκB表达的相关性 糖尿病组TGFβ1阴性表达对象中NFκB阳性表达为24眼(63.2%)，TGFβ1阳性表达对象中NFκB阳性表达为46眼(85.2%)，提示糖尿病患者结膜上皮细胞TGFβ1表达程度与NFκB表达水平呈正相关.

　　3 讨论

　　据报道,泪膜的稳定性与结膜上皮炎症水平和炎症状态下的增生情况有关，而这种炎症反应可能为各种类型干眼症的共同发病机制[6，7].TGFβ是多功能细胞因子，在抑制炎症细胞的活化和增殖中起重要作用[8,9].NFκB是与许多靶基因的转录启动有关的免疫球蛋白，在细胞生长分化、炎症与免疫应答、肿瘤生长及病毒繁殖中发挥重要调节作用[10].NFκB的活化可促进炎性因子的表达，而炎性因子表达的增强又可使NFκB的活性进一步增强，加重炎症.本研究结果表明，正常人结膜上皮细胞TGFβ和NFκB的表达主要呈阳性或弱阳性，而糖尿病患者结膜上皮细胞TGFβ和NFκB的表达较对照组明显增强，尤其是NFκB的表达更为显著.糖尿病患者结膜上皮细胞TGFβ和NFκB的表达越强，泪膜的稳定性越差，即TGFβ及NFκB的表达越强，BUT值及基础泪液分泌试验值越小.但TGFβ的表达与角膜荧光素染色程度无明显相关性，其原因可能与TGFβ特异性不强有关.本研究结果亦表明,糖尿病患者结膜上皮细胞TGFβ表达程度与NFκB表达水平呈正相关,故糖尿病患者引起干眼症的原因可能与结膜上皮细胞TGFβ和NFκB的表达增强有关.总之，糖尿病患者BUT值和基础泪液分泌试验值减少，角膜荧光染色程度增强，是干眼症的易患人群.

　　【参考文献】

　　[1] Jones DT， Monroy D， Ji Z， et al..Alterations of ocular surface gene expression in Sjogren’s syndrome[J].Adv Exp Med Biol，1998，438：533.

　　[2] Pflugfelder SC， Jones D， Ji Z， et al..Altered cytokine balance in the tear fluid and conjunctiva of patients with Sjogren’s syndrome kerato conjunctivitis sicca[J].Curr Eye Res,1999，19(3)：201.

　　[3] Press NS， Perillo E.TGF and TGFβ3 immunoreactivity within the cilliary epithelium[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，1994，35：453.

　　[4] Kane CJA， Hebda PAH， Mansbridge JN， et al..Direct evidence for Spatial and temporal regulation of transforming growth factor expression during cutaneous wound healing[J].J Cell Physiol，1991，148.

　　[5] Li Q，Verma IM. NFκB regulation in the immune system[J].Nat Rev Immunol，2002，2：725.

　　[6] Subota K， Satake Y， Ohyama M， et al..Surgical reconstruction of the ocular surface in advanced ocular cicatricial pemphigoid and Stevensohnson syndrome[J].Am J Ophthalmol，1996，122：38.

　　[7] Francoise B， Pierre PJ，Jean MDS，et al..Flow cytometric analysis of inflammatofy markers in KCS 6month treatment with topical cyclosporine A[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2001，42：90.

　　[8] Massague J.TGF signal transduction[J].Annu Rev Biochem，1998，67(7)：753.

　　[9] Assoian RK， Komoriya A， Meyers CA， et al..Transforming growth factorbeta in human platelets[J].J Biol Chem，1983，258：7155.

　　[10] Tian B， Brasier AR.Identification of a nuclear factor kappa B dependent gene network[J].Recent Prog Horm Res，2003，58：95.