KOH涂片镜检法诊断真菌性角膜炎的意义

　　作者：杨莉萍　黄文明　樊翌明　李瑞庄 作者单位：广东医学院附属医院 检验科; 皮肤科; 眼科，广东湛江 524001

　　【摘要】目的:探讨KOH涂片镜检法对真菌性角膜炎的诊断意义，了解湛江地区真菌性角膜炎的病原学。方法:取102例真菌性角膜炎患者的角膜溃疡标本，作KOH涂片镜检、真菌培养及菌种鉴定。结果:KOH涂片镜检法和真菌培养法的阳性率分别为97.1%(99/102)、94.9%(93/98)，二者的真菌检出率差异无显著性(P>0.05)。93份培养阳性标本中，共分离出18属33种真菌，其中镰刀菌属、弯孢霉属和曲霉属真菌分别占36.6%、27.9%、7.5%。结论:KOH涂片镜检法是早期诊断本病的简单、有效方法。镰刀菌和弯孢霉是湛江地区真菌性角膜炎的主要致病菌。

　　【关键词】 角膜炎;真菌;培养

　　Diagnostic value of potassium hydroxide based smear assay for fungal keratitis

　　YANG Liping, HUANG Wenming, FAN Yiming, LI Ruizhuang

　　(Laboratory Department, The Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524001, China)

　　【Abstract】 Objective: To investigate the diagnostic value of potassium hydroxide based smear assay for mycotic keratitis and the pathogenic spectrum in Zhanjiang area. Methods: The corneal scrapings from 102 patients with fungal keratitis were subjected to 10% KOH based smear before microscopic observation, fungal culture and strain identification. Results: The positive rates of fungal infection of fungal keratitis detected by KOH based smear and fungal culture were 97.1% (99/102) and 94.9% (93/98), respectively, and there was no significant difference in the fungal detection efficiency between the two methods (P>0.05). The pathogenic fungi belonged to 18 genus and 33 species; of which, Fusarium, Curvularia and Aspergillus accounted for 36.6%, 27.9% and 7.5%, respectively. Conclusion: The KOH based smear is simple and effective in the early diagnosis of fungal keratitis. Fusarium and Curvularia are the predominant pathogens of mycotic keratitis in Zhanjiang district.

　　【Key words】 keratitis; fungus; culture

　　真菌性角膜炎的患病率在我国呈逐年上升趋势，其致病菌迄今已多达70种[1]。真菌性角膜炎的处置不当将导致角膜穿孔、失明甚至眼球摘除，而治疗的成功和视力的恢复取决于早期、快速、正确的诊断。虽然KOH涂片镜检法目前仍是发展中国家快速诊断真菌性角膜炎的主要检测方法，但国内有关其对本病的诊断意义的报道少见[26]。本文分析了我院2003年10月～2005年12月间诊治的102例真菌性角膜炎的真菌学检查结果，旨在了解KOH涂片镜检法对真菌性角膜炎的诊断意义。

　　1 资料与方法

　　1.1 病例资料

　　102例患者中，男71例，女31例，年龄6～85岁(平均48.7岁)，病程3～60 d(平均13.9d);均为单眼患病，其中右眼55例，左眼47例;农民89例，工人9例，学生4例。58例有明确的眼外伤史，引起外伤的异物为谷粒或谷尘(20例)、可疑尘埃(20例)、泥土(5例)、木屑(4例)、甘蔗叶(3例)、焊屑(2例)、水泥粉(1例)、竹片(1例)、橘叶(1例)、草刺伤(1例)。

　　1.2 标本采集

　　1%的卡因行患眼表面麻醉，2 min后在无菌操作下用手术刀刮取角膜溃疡组织，置于含少量灭菌生理盐水的无菌离心管中送检。

　　1.3 KOH涂片镜检

　　用无菌白金耳挑取适量送检的角膜溃疡组织置于载玻片上，涂片时尽量将角膜组织薄层铺开，加1滴10% KOH液，盖上盖玻片，显微镜下查找真菌。

　　1.4 真菌培养

　　将余下的角膜溃疡组织接种于2支沙氏培养基(SDA)试管斜面上，27 ℃培养2～3周，观察有无真菌生长。

　　1.5 菌种鉴定

　　2支SDA试管中均有真菌生长，且菌落形态一致者，初步确定其为致病菌。取其菌落移种于葡萄糖马铃薯琼脂(PDA)或察氏培养基平皿上，27 ℃培养2周，观察其生长形态及速度;同时将菌落移种于PDA或察氏培养基行微量培养，每天镜下观察真菌菌丝和分生孢子生长情况。根据菌落颜色、形态、生长速度及有无液体渗出，以及菌落涂片和微量培养镜下菌丝颜色、形态和分生孢子的形态、结构及产孢方式等特点，进行菌种鉴定[78]。

　　1.6 统计学处理

　　采用配对卡方检验。

　　2 结果

　　102份角膜溃疡标本中均检出真菌，其中4份因缺乏标本而未作真菌培养。KOH涂片镜检102份，其中阳性99份(97.1%)，阴性3份(2.9%);真菌培养98份，其中阳性93份(94.9%)，阴性5份(5.1%)(表1)。在KOH涂片镜检阴性的3份标本中，真菌培养分离出面包串珠霉菌、顶套菌和丛生菌各1例。真菌一般在3～4 d内开始生长，但培养基需要保存4～6周。93份培养阳性标本中，共分离出18属33种真菌，其中以镰刀菌属、弯孢霉属和曲霉属真菌多见(表2)。

　　表1 98份角膜溃疡标本中KOH涂片镜检法与真菌培养法结果的比较(略)

　　KOH涂片镜检法与真菌培养法对真菌的检出情况比较，χ2 =0.125，P>0.05

　　表2 93例真菌性角膜炎的致病真菌分类(略)

　　3 讨论

　　虽然临床表现有助于真菌性角膜炎的诊断，但明确诊断依赖于实验室检查，如角膜刮片或活检标本直接镜检、染色检查、组织病理检查、真菌培养、共焦显微镜和PCR技术[23]。尽管真菌直接镜检不能鉴别感染的菌种，但其是快速诊断真菌性角膜炎的重要方法。以真菌培养为标准，KOH涂片镜检法对真菌性角膜炎的敏感度为72.2%～91%，Gram染色为31.6%～98.0%，Giemsa染色为27.0%～85.0%，calcofluor white (CFW)染色为80.0%～90.0%，PAS染色为91.0%，六胺盐染色为56.0%～89.0%，乳酚棉蓝(lactophenol cotton blue)染色为70.0%～80.0%，吖啶橙染色为65.0%[23]。共焦显微镜检查和PCR技术尽管在本病的诊断中已显示出良好的应用前景，但还有许多问题需进一步研究。

　　KOH涂片镜检法诊断真菌性角膜炎的敏感性为81.2%，特异性为83.8%[4];其与真菌培养法结果的阳性一致率为82.0%～90.0%[5]。本文结果显示KOH涂片镜检法对真菌的检出率高达97.1%，其与真菌培养法的检出率差异无显著性。因此，KOH涂片镜检法具有简单、快捷、价廉、结果可靠的优点，可作为早期诊断真菌性角膜炎的主要方法。高倍镜下见到无色透明的菌丝可初步考虑为丝状真菌感染，而见到无色、折光性强、大小不一的孢子则考虑为酵母菌感染。由于真菌具有向角膜组织内生长的特性，故在取材时要先擦除表面的坏死组织，再用刀片反复刮取角膜溃疡底部和边缘组织。另外，在涂片时要尽量将角膜组织薄层铺开，这样可更清晰地显示真菌菌丝和孢子。

　　由于真菌培养可提高病原体的检出率、鉴定菌种和进行药敏试验，故其目前仍是诊断真菌感染的“金标准”[23，5]。虽然改良SDA培养基足以分离出各种不同的眼部真菌，但最好联合应用固体和液体培养基分别在37　℃、25～30　℃环境下进行培养[2]。Rosa等[9]用改良SDA培养基进行真菌性角膜炎患者的角膜刮片培养，发现培养阳性率为90%，2 d、3 d和1周内的阳性率分别为54.0%、83.0%、97.0%。病例的选择是影响真菌培养阳性率的主要因素，如化脓性角膜炎的阳性率为20.0%～50.0%，真菌性角膜炎为50.0%～80.0%[5]，本文则高达94.9%。在本组病例中，有3例患者作直接镜检阴性，但真菌培养阳性。因此，对于可疑的真菌性角膜炎患者，均需同时作KOH涂片镜检和真菌培养与鉴定，有条件者还应作药敏试验，从而避免漏诊和指导治疗。

　　虽然真菌性角膜炎的致病菌存在明显的地域性差异，但其种类在过去的20a中并未发生明显的变化[3]。丝状真菌和暗色真菌(弯孢霉属、离蠕孢属)是其主要致病菌，而酵母和酵母样真菌较少见[2]。Gopinathan等[6]总结了印度南部1352例真菌性角膜炎患者的实验室检查结果，发现镰刀菌属、曲霉属和弯孢霉属分别占37.2%、30.7%、2.8%。国内调查显示：华北地区和郑州地区真菌性角膜炎的致病菌属相同，依次为镰刀菌属、曲霉属和青霉属;华南地区在1975～1986年期间的主要致病菌依次为曲霉属、镰刀菌属和青霉属，而1989～1997年期间则变为镰刀菌属、曲霉属和弯孢霉属[10]。本组病例的主要致病菌依次为镰刀菌属、弯孢霉属和曲霉属，镰刀菌属中以茄病镰刀菌最多见。虽然湛江地区在地理位置上与广州较接近，但本文所见的弯孢霉属明显多于宋书华等[5]的报道，而曲霉菌属较少见。

　　【参考文献】

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　　[7] 孙鹤龄. 医学真菌鉴定初稿 [M]. 北京: 科学出版社, 1987.

　　[8] 叶世泰, 乔秉善, 路英杰. 中国致敏空气真菌学 [M]. 北京: 人民卫生出版社, 1992.

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　　[10] 王丽娅，张月琴，王印其，等. 中国三地区真菌性角膜病致病菌种的调查[J].中华眼科杂志，2000，36(2)：138140.