骨桥蛋白与VEGF在增生性糖尿病视网膜病变玻璃体液中的表达

　　作者：马艳萍,朱承华 作者单位：上海梅山医院 眼科,江苏 南京 210039;南京医科大学第一附属医院 眼科,江苏 南京 210029

　　【摘要】目的：探讨骨桥蛋白(osteopontin,OPN)与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy PDR)中的作用,并初步分析OPN及VEGF与PDR间的相关关系,为研究PDR的发病机制、预防及治疗提供实验依据和理论基础。方法：取2008年3月至2008年12月间PDR 28例(PDR组)和特发性黄斑裂孔(IMH)24例(IMH组)患者的玻璃体液样本,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)定量测定玻璃体液中OPN及VEGF浓度，应用SPSS 11.5统计学软件进行数据分析。结果：PDR组玻璃体液中OPN浓度为(883.39±151.12) ng·ml-1,VEGF浓度为(1 158.68±140.98) pg·ml-1;IMH组OPN浓度为(537.88±166.37) ng·ml-1,VEGF浓度为(295.91±109.62) pg·ml-1。PDR组较IMH组不仅OPN表达增高(P<0.01),VEGF也表达增高(P<0.01);PDR组玻璃体液中OPN浓度与VEGF浓度呈正相关(r=0.69,P<0.01)。结论：PDR患者玻璃体液中OPN与VEGF含量高于非糖尿病患者,OPN与VEGF在PDR病理性新生血管的发生、发展中可能起到促增生作用。

　　【关键词】 骨桥蛋白; 血管内皮生长因子; 增生性糖尿病视网膜病变; 玻璃体液

　　Expression of osteopontin and vascular endothdial growth factor of vitreous in patients with proliferative diabetic retinopathy

　　MA Yanping,ZHU Chenghua

　　(Department of Ophthalmology,Shanghai Meishan Hospital,Nanjing 210039,China;Department of Ophthalmology,the First Affliliated Hospital to Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)

　　[Abstract] Objective:To investigate the levels of osteopontin (OPN) and vascular endothelial growth factor (VEGF) of vitreous in patients with proliferative diabetic retinopathy(PDR),and to explore the association between OPN,VEGF and the development of PDR. Methods: The levels of OPN and VEGF in the vitreous of 28 eyes of 28 patients with proliferative diabetic retinopathy (PDR group) and 24 eyes of 24 patients with idiopathic macular hole (IMH group) were measured by enzymelinked immunosorbent assay(ELISA).Vitreous fluid samples were obtained by vitrectomy.Results:The vitreous level of OPN was significantly higher in PDR group [(883.39±151.12) ng·ml-1] than in IMH group [(537.88±166.37) ng·ml-1,P<0.01].The vitreous concentration of VEGF was also significantly higher in PDR group[(1 158.68±140.98) pg·ml-1] than in IMH group [(295.91±109.62 pg·ml-1),P<0.01].The vitreous concentration of OPN correlated significantly with that of VEGF in PDR group [(correlation coefficient) r=0.69,P<0.01]Conclusions:Vitreous levels of both OPN and VEGF in patients with PDR are significantly higher than those of nondiabetic patients.OPN is probably correlated with VEGF in angiogenesis in PDR.

　　[Key words] osteopontin; vascular endothelial growth factor; proliferative diabetic retinopathy; vitreous

　　糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最常见和最为严重的微血管并发症,特别是增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy, PDR)可引起糖尿病患者严重的视力丧失。据统计,2型糖尿病患者致盲原因中DR的致盲率为33%,1型糖尿病患者则高达86%[1]。玻璃体液是高惰性的，并且受血—视网膜屏障保护，能间接反映视网膜分泌的细胞因子水平。玻璃体切割手术时获得的玻璃体液使对人眼中细胞分子水平的研究成为可能。骨桥蛋白(steopontin,OPN)与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前增生性视网膜疾病研究的热点，本实验采用酶联免疫吸附试验(ELISA)定量测定OPN和VEGF含量,通过对PDR与非DR患者玻璃体液中OPN与VEGF含量的比较及分析,初步了解OPN和VEGF之间的关系,以及两者与PDR发生、发展之间的关系。

　　1 资料和方法

　　1.1 一般资料

　　收集南京医科大学第一附属医院眼科2008年3月至2008年12月28例(11男,17女)PDR患者(PDR组)的玻璃体液,年龄30～75岁;选取特发性黄斑裂孔(IMH)患者玻璃体液样本24例(7男,17女)作对照组(IMH组),年龄52～77岁。两组间年龄、性别差异均无统计意义。诊断标准参照DR国际分类法(1983年),直接、间接眼底镜检查及眼B超和眼底荧光造影(FFA)检查结果。两组均行现代闭合式玻璃体切割手术,排除眼外伤、高度近视以及眼底静脉阻塞等引起的玻璃体视网膜病变等病例。

　　1.2 标本采集

　　玻璃体液取样：开睑后以0.5 g·L-1碘伏稀释液消毒结膜囊,无菌生理盐水反复冲洗,无菌纱布吸尽结膜囊中残液,在玻璃体腔灌注前由睫状体平坦部抽取玻璃体液样本,约0.2 ml,标本移至已消毒并硅化的0.5 ml Eppendorf管,存放于-70 ℃冰箱备用。

　　1.3 实验材料

　　人OPN试剂盒(human osteopontin immunoassay,catalog number DOST00，美国R&D公司产品),550型酶标仪(美国),Taq酶(5 U·μl-1，美国Invitrogen公司),IQ5荧光定量仪(BIOrad公司)。

　　1.3.1 玻璃体液OPN与VEGF浓度测定

　　从冰箱中取出标本,置于室温下10 min待测。根据ELISA试剂盒的说明,将标准品用稀释液定比稀释,充分混匀。将酶标板各孔依次编号,每孔加RD16 100 μl,并加入50 μl 标准液或样品,混匀封口。室温下孵化2 h,弃液,冲洗液清洗4次。每孔加入200 μl OPN Conjugate,封口室温下孵化2 h。弃液,冲洗液清洗4次。避光情况下每孔加入200 μl底物显色溶液,混匀,孵化30 min。再每孔加50 μl反应终止液,混匀。酶标仪550 nm处读数,30 min内测定各孔吸光度值(A值)。VEGF测定方法类似。根据定比稀释标准品的A值绘制标准曲线,以样品的A值和标准曲线算出样品中OPN与VEGF的含量。

　　1.4 统计学处理

　　实验数据均以x-±s表示,使用SPSS 11.5软件包进行两样本均数的t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　见表1。表1 PDR与IMH组玻璃体液中OPN与VEGF水平(略)

　　由表1可见PDR组OPN及VEGF表达均较IMH组增高(P<0.01)。经分析PDR组OPN与VEGF相关性回归方程为Y=549+0.690X,见图1。

　　3 讨论

　　PDR的病理机制是血—视网膜屏障的破坏及视网膜新生血管形成造成的玻璃体视网膜增生性改变。OPN是一种带负电荷的分泌性磷酸化糖蛋白,它具有钙结合域、凝血酶裂解位点、整合素以及RGD结合序列等多个功能结合区,可由多种组织细胞合成与分泌,其在许多系统疾病中被发现。OPN参与多种组织细胞损伤的修复过程,有促细胞移动、黏附和增生分化等功能,是一种增生相关蛋白[2]。在基因水平的研究[3]已经证实,OPN在增生相关性疾病中显著高表达,但在PDR中对OPN的临床研究目前还较少。动物研究[4]证实：OPN多存在于视网膜神经节细胞层,在其他视网膜层分布较弱。本研究测得PDR病例玻璃体液中OPN浓度为(883.39±151.12) ng·ml-1,较IMH组(非糖尿病) [(537.88±166.37) ng·ml-1]明显升高。另有研究[5]对PDR病例玻璃体液中OPN与血浆中OPN水平进行了比较,发现其浓度明显高于血浆,故非血眼屏障破坏等因素可以解释玻璃体液中OPN浓度高于血浆中OPN浓度,说明PDR病例玻璃体中的OPN可能由眼内产生,提示了OPN水平升高可能在增生性糖尿病视网膜病变的病理过程中起了一定的作用。Chidlow等[4]以兴奋性中毒和局部缺血损伤后的小鼠模型视网膜进行了OPN表达的时间和定位检测,通过mRNA分析和免疫组织化学的方法发现,在模型眼中出现了OPN mRNA上调,具体产生的细胞尚不明确,增高的OPN通过RGD序列和与视网膜血管内皮细胞的整合素受体结合后引起聚集黏附激酶(FAK)磷酸化,通过Grb2/SOS或FAK/Src激活Ras、MAPK途径,调节细胞骨架蛋白组装，细胞的聚集、黏附，血管内皮细胞增生和视网膜新生血管的生成。

　　血管源性因子是导致糖尿病视网膜细胞异常增生和新生血管生成的主要原因。前期研究[6]揭示,VEGF及其受体在正常角膜各层均有表达,但表达量很低,而在眼部一些疾病中则高表达,能促使内皮细胞的增生、迁移,蛋白水解和病理性血管生成。VEGF能特异性作用于视网膜血管内皮细胞,是最直接的眼内新生血管形成因子。大量临床研究[7]显示,DR患者玻璃体和视网膜VEGF水平升高,且随着DR严重程度的增加,VEGF相应增多,其受体水平也随之升高。缺氧可诱导视网膜细胞内缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factorl,HIF1)的活性增强,上调VEGF等血管形成因子的表达,产生的VEGF通过与其特异性受体结合激活其下游的一系列蛋白,如激活磷脂酶C,水解磷脂酰肌醇二磷酸,产生二脂酰甘油DAG和肌醇三磷酸IP3,DAG可激活胞浆内蛋白激酶C,进而启动细胞内系统,主要对毛细血管后静脉和小静脉施加影响,增加其通透性,可使血液中的大分子物质进入细胞外基质中,形成纤维蛋白凝胶等,有利于新生血管和基质细胞生长[8]。同时VEGF还可以诱导蛋白水解酶、组织因子、基质胶原酶等在内皮细胞的表达,激活第Ⅶ因子从内皮细胞释放,改变细胞外基质(ECM),介导内皮细胞迁移和浸润,以利于血管生成[9]。反面证据是向鼠眼内注入VEGF受体Flt或Flk拮抗剂,可分别使视网膜新生血管形成减少100%和95%[10]。在本研究中,PDR患者玻璃体VEGF的平均含量[(1 158.68±140.98) pg·ml-1]明显高于对照组(IMH组)的[(295.91±109.62) pg·ml-1],与国外报道一致。通过VEGF平均浓度的比较更直接地反映了新生血管活动性的水平,验证了VEGF在PDR的发生、发展中起着重要作用。

　　本实验统计分析表明,玻璃体液的OPN与VEGF含量呈显著正相关(r=0.69,P<0.01)。Shijubo等[11]研究证实,在肿瘤生成的病理机制中VEGF能诱导OPN水平升高，进一步导致上皮细胞迁移,使新生血管生成促进肿瘤生长和转移,但具体机制尚不清楚。因此,我们推测,在PDR患者由视网膜微循环缺氧作为始动因素,导致OPN和VEGF水平上调,两者作用于视网膜血管内皮细胞不同的受体,通过不同的途径共同促进病理性视网膜新生血管的形成。

　　综上所述,我们的研究结果提示,OPN和VEGF共同参与PDR患者病理性新生血管的形成过程。但由于PDR形成涉及多种因子,可能存在多条影响途径,故其具体增生机制仍是困扰人们的一个难题。病理情况下OPN的分布,何种视网膜细胞分泌来源,OPN分泌与病程时间、相关细胞因子之间的关系以及OPN发挥生理功能的具体通路,何种药物能够减少OPN的生成等仍不清楚,需要我们今后进一步的研究来明确,为PDR的预防和治疗引入新的有效思路和方法。

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