视网膜母细胞瘤发病机制的分子生物学研究回顾与进展

　　作者：李雁,张军军 作者单位：(610041)中国四川省成都市，四川大学华西医院眼科

　　【摘要】视网膜母细胞瘤( retinoblastoma,RB)是婴幼儿最常见的一种眼内恶性肿瘤, 不仅严重影响患儿的视力，更危及生命。随着生物学技术的迅猛发展，RB的生物学研究已取得一些突破，探讨RB的发病机制对抑制肿瘤的生长和转移,提高患儿的生存率,具有重要的临床意义。现将视网膜母细胞瘤发病机制的研究进展综述如下。

　　【关键词】 视网膜母细胞瘤;基因突变;p53;鼠双微粒体2;Rb蛋白

　　Review and progress of retinoblastoma pathogenesis in molecular biology

　　Yan Li, JunJun Zhang

　　Department of Ophthalmology, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

　　Abstract　Retinoblastoma is a common pediatric eye malignant tumor, it not only seriously affects childrens eyesight, but also endangers their lives. With the rapid development of biological technology, some breakthroughs have been made in retinoblastoma biological research. It has an important clinical significance to explore the pathogenesis of retinoblastoma in order to inhibit tumor growth and metastasis and improve the survival rate of children. Now the pathogenesis of retinoblastoma research is summarized.

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　　KEYWORDS: retinoblastoma; mutation; p53; MDM2; pRb

　　0　引言

　　视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是发生于婴幼儿时期最为常见的眼内恶性肿瘤[1]，出现首个体征的平均年龄为生后7mo(双侧发病病例)和24mo(单侧发病病例)[2]，严重危害着患儿的视力和生命，已经受到医学界的广泛关注。我国每年新病例约有1000人，占全世界每年新病例的20%。其中30%～40%的病例属于遗传型，符合常染色体不完全显性遗传，外显率约90%;60%～70%的病例属于非遗传型。遗传型是由生殖细胞突变引起，变异存在于每一个体细胞中;非遗传型，基因突变仅发生在视网膜细胞。因此，遗传型RB通常为双侧、或单眼多发性;非遗传型则以单侧、散发型多见。

　　RB是人类特有的一种视网膜肿瘤，对其成因学者们提出了许多假说:1971年，Knudson[3]的二次突变假说认为RB需要经历某个基因的两次突变才能发生;Benedict等[4]在1983年提出类似Knudson的假说;同年Cavenee证实了两个等位基因的失活致RB发生，该基因位于13q14位点，编码pRb蛋白，靠近脂酶D的编码区，命名为Rb1基因。pRb在细胞的增殖和分化中起重要作用，决定细胞是否进入S期[5]。Rb1基因启动子包含多个转录因子的结合位点(RBF1, Sp1, ATF和E2F)[6]，遗传型Rb在这些位点上发生突变，造成转录调节因子无法结合，降低了转录活性[7]，导致细胞内pRb功能低下或缺失，细胞的正常周期被打破，表现出细胞快速生长形成肿瘤。

　　1　RB基因突变

　　1970年代，Knudson[3]首次提出视网膜母细胞瘤发生的“二次突变学说”，即一个正常的视网膜母细胞瘤变成肿瘤细胞需发生2次突变。随机发生的2次突变可使RB基因中正常的等位基因失活。当两个等位基因均发生突变，由体细胞的杂合子型变成了纯合子状态，细胞将失去正常RB蛋白功能，细胞分化失去控制，从而形成肿瘤。1980年代，对RB基因的位置和作用方式有了基本了解。多位学者对RB肿瘤细胞内RB基因及产物进行详细分析[8,9]：(1)在DNA分子水平，大约15%～30%的RB肿瘤显示RB基因结构异常，主要限于显示大的缺失、易位、重组以及影响限制性酶切位点的点突变;(2)在mDNA表达水平，更多的RB肿瘤表现出低于正常胎儿视网膜或分子量大小异常。RB的mDNA异常被认为是由于不同的RB基因点突变对mDNA稳定性转录及剪接影响所致;(3)在蛋白质水平，绝大多数RB或缺失RB蛋白或仅表达少量的或分子量异常的RB蛋白。RB基因突变的类型：(1)大片段缺失[811]：即大片段(全部或部分)RB基因缺失，缺失断裂点可出现于整个RB基因范围内(外显子13～17区域内);(2)在基因编码序列中缺失或插入几个碱基，引起阅读框架移位[1214]。(3)点突变:按其性质可分为2类:错义突变和无能突变。据文献统计，遗传型患者中，仅25%有阳性家族史，多数RB患者为新发生的生殖细胞突变。这说明RB发病过程除了基因突变外可能有其他机制的参与。

　　2　癌基因、抑癌基因论

　　近年来，对RB中一些癌基因和抗癌基因的研究开始引起人们的重视。越来越多的研究表明，视网膜母细胞瘤的发生、发展是一个复杂的过程，有多个癌基因和抑癌基因的异常改变，其中MDM2基因的扩增或过表达及p53基因突变有着举足轻重的作用。我们着重对P53及与其可能相关的癌基因MDM2做一综述。p53为一公认的抗癌基因，50%以上的肿瘤组织中可检测到它的突变。肿瘤抑制基因p53位于人类17号染色体短臂17P13.1上，其编码产物位于细胞核，是一种分子量约为53KD的含磷蛋白，可分为野生型和突变型两种。正常细胞所产生的P53蛋白(野生型)很少，而且在细胞中易水解，半衰期为20min左右，用常规免疫组化方法难以检出[15]。突变型p53基因由野生型突变产生，失去抑癌基因活性，可导致正常细胞恶性转化、肿瘤发生[1618]。因其多积聚在细胞核内，稳定性增加，半衰期延长，故可通过免疫组织化学染色检测[17]。在正常细胞中，p53信号通路主要调节细胞损伤后反应(修复或凋亡)[19]。研究发现[2023]，RB组织中有高水平的突变型p53基因蛋白表达，提示p53基因突变与RB发生关系密切。p53基因突变与P53蛋白过度表达间的高度一致性己经被证实[24]。

　　MDM2是一种癌基因，其主要的功能是与野生型或突变型P53蛋白的相互作用[25]。野生型p53基因诱导MDM2转录增强，致使MDM2蛋白水平升高;反过来，MDM2蛋白与P53结合形成复合物，促使P53蛋白降解，抑制其功能的发挥，二者构成了负反馈调节环。通过这种调节，二者在细胞内能处于平衡状态，这即利于DNA损伤后的修复，同时又防止修复后细胞生长受阻[26]。研究表明：MDM2P53负反馈调节环异常可导致细胞中抑癌基因p53功能失活，与多种肿瘤的发生发展密切相关[27] 。MDM2(鼠双微粒体2)癌基因定位于12q13 14，多项实验证实了该基因能使体外细胞发生转化并具有动物成瘤性[28，29]。

　　MDM2还可通过P53非依赖性方式在肿瘤的发生、发展中起作用。最近新的研究表明MDM2和P53的调节通路有新的酶化途径参与[30]，这表明两者之间的作用不是单一途径。

　　3　其他观点

　　Rb基因编码的Rb蛋白(pRb)是一种具有广泛生物学意义的转录调节因子,为具有DNA结合能力的核磷酸化蛋白，主要参与细胞周期的调节，对细胞生长起负调控作用，它是调节细胞增殖信号通路的中心成分。近期研究认为，pRb与RB的发生密切相关。

　　pRb作用于肿瘤的发生、发展可能是通过两种机制:(1)细胞周期调控作用，pRb及其相关蛋白是决定细胞分裂增殖还是休止、分化的重要分子[31]。pRb的功能受磷酸化状态影响，pRb以非磷酸化的活性形式与转录因子E2F结合而抑制其活性，阻止细胞从G1期进入S期[32]，抑制细胞增殖，而pRb的磷酸化可使其失活。(2)诱导细胞凋亡，通过p53依赖和p53非依赖的细胞凋亡途径，诱导细胞凋亡[33]。有研究表明[3436]：pRb功能异常导致中心体和非整倍体的扩增。这就意味着pRb与中心体扩增和染色体稳定性有关。最近研究发现：肿瘤的发生开始于干细胞的表观遗传变异，这就意味着基因表达的后天性缺失(非突变性的)比突变更常见。所以就有人提出质疑“二次基因突变论”的合理性。

　　4　展望

　　众所周知，肿瘤的发生和发展是一个复杂的过程,有很多影响因素,包括癌基因的激活、抗癌基因的失活、凋亡机制的异常及其他因子的改变。肿瘤细胞既是分化紊乱的产物又是增殖失控的产物。视网膜母细胞瘤亦是如此。目前的研究还没有对RB的发病机制做出较权威的结论，但其分子生物学研究取得了一定进展，我们了解到RB的发生不仅是基因突变那么简单，可能有抑癌基因、癌基因、抗凋亡因子的参与，我们已了解了相当一部分，以后要继续完善研究它们之间的内在关系及相互影响，找出RB发病的主要机制。从分子水平重新认识RB的发生、发展规律，具有明显的理论价值与广泛的应用前景，能为以后基因治疗RB提供科学依据。

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