VEGF 、MVD与角膜新生血管形成关系的实验研究

　　作者：吴娟 张煦 作者单位：1.西宁中古友好眼科医院 ; 2.兰州大学医学院病理教研室

　　【摘要】 目的 探讨血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor , VEGF )在大鼠角膜碱烧伤后新生血管形成中的作用。方法 利用氢氧化钠烧灼大鼠角膜表面，建立大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization, CNV)模型，每日裂隙灯下观察角膜新生血管的发展，并分别于烧伤后1、4、7、14、21d处死大鼠，摘除角膜做病理切片，行微血管密度(Microvessel density，MVD)测定;免疫组化法检测VEGF的表达;图像分析系统测定该因子的蛋白表达。结果 免疫组化显示：VEGF在CNV中的阳性表达逐渐增加，于7 d表达最明显， 21 d后几乎无表达;MVD测定结果以CNV 7～14 d组血管密度最高;图像分析系统结果与免疫组化染色结果一致。结论 碱烧伤后CNV形成中，VEGF的表达增加，CNV中MVD与VEGF的表达呈正相关。

　　【关键词】 血管内皮生长因子 角膜新生血管 微血管密度 碱烧伤

　　EFFECT OF VEGF ON CORNEAL

　　NEOVASCULARIZATION AFTER ALKALI BURN

　　Wu Juan1 , Zhang Xu2

　　(1 China-cuba friendship ophthalmologic hospital in Xining,

　　2 Department of pathology, Lanzhou university medical college)

　　Abstract Objective To study the role of VEGF in corneal neovascularization after cauterization with alkali. Methods Corneal neovascularization was induced by NaOH cauterizing the surface of cornea in 40 rats. Slit-lamp biomicroscopy revealed a gradual development of corneal neovascularization. Animals were grouped and sacrificed at 1d, 4d, 7d, 14d,and 21d after CNV respectively. The corneas were enucleated for histopathological examination; Microvessel density was counted; the expressions of VEGF was studied by immunohistochemistry, and the results was analyzed by picture quantitative analysis techniques. Results The number of MVD in CNV 7～14d group was the highest; Immunohistochemistry demonstrated: the positive expression of VEGF in CNV progressed gradually, and involved the entire cornea on the 7 days post-treatment. After 7 days the expression decreased, however, 21 days post treatment the positive expression was not found. Conclusion The positive expression of VEGF in CNV increases gradually, The expression of VEGF is positively correlated with MVD.

　　Key words Vascular endothelial growth factor Corneal neovascularization Microvessel density Cauterization with alkali

　　角膜组织无血管，各种病因导致的角膜疾病大都合并有角膜新生血管(CNV)增殖。研究CNV的形成机制，通过不同途径干预CNV的形成一直是眼科界的焦点课题。近年来，血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor , VEGF )成为与新生血管有关疾病如肿瘤、新生血管性青光眼、增殖性糖尿病视网膜病变等的研究热点。大量实验证实了VEGF在血管形成中的中心作用，而 VEGF在角膜中的表达及在CNV形成中的作用尚未明确，国内外报道较少。有关微血管密度(Microvessel density，MVD)与角膜新生血管形成中相关因子的表达关系的研究鲜见。本实验用免疫组化法研究了大鼠角膜碱烧伤后新生血管形成中VEGF的表达及其作用，并行MVD测定，旨在探讨VEGF、MVD 与CNV的相关性，从而进一步阐明CNV形成中的蛋白分子背景，为临床上治疗角膜化学烧伤等所致的角膜新生血管性疾病提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂

　　兔抗大鼠VEGF多克隆抗体、兔抗人VIII多克隆抗体、SABC试剂盒、正常非免疫动物血清、过氧化酶阻断剂 、二抗、链霉菌抗生物素-过氧化物酶均由武汉博士得生物技术公司提供。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 实验动物

　　40只标准化清洁级健康成年SD大鼠，雌雄各半，体重178～204 g, 裂隙灯检查无眼病，由青海省实验动物中心提供。按碱烧伤后1 、4 、7 、14 、21 d不同时间随机分成5组，每组8只，右眼为实验组，左眼为正常对照组。

　　1.2.2 制作大鼠角膜新生血管动物模型

　　烧伤前所有大鼠均采用乙醚吸入麻醉，0.5%盐酸丙美卡因滴眼液点眼行局部麻醉，直径3 mm的单层滤纸片浸泡在1N NaOH溶液中，达饱和状态，吸水纸吸取多余液体，将滤纸片置于大鼠角膜中央2 min，第1 min后，加用2N NaOH溶液25 μl， 点在滤纸中央，用棉签拭去过多水分，再留置1 min, 用生理盐水充分冲洗眼部1 min, 放回笼后按正常环境饲养。所有实验大鼠每日裂隙灯下观察角膜新生血管形成及发展情况。

　　1.2.3 免疫组化测定VEGF的表达

　　1.2.3.1 标本处理、病理组织切片观察

　　5组大鼠分别于烧伤后1、4 、7、14 、21 d用颈椎脱臼法处死，迅速摘除带1 mm宽巩膜的角膜组织，用10%甲醛固定24～48 h，常规行逐级梯度酒精脱水，二甲苯致透明化，常规石蜡包埋，4 μm连续切片，HE染色。光镜下观察。

　　1.2.3.2 MVD测定

　　参见Maeda[1]观察法，在200倍光镜视野下记数阳性血管数，单个血管内皮细胞着色即作为1个记数单位，不是以是否形成管腔或管腔内有无红细胞作记数标准，每例选择5个不重复视野记数，然后计算每例CNV的单位视野(×200)平均血管数，即间质MVD，结果用均数±标准差即

　　2 结果

　　2.1 常规病理组织切片观察

　　切片用HE染色，在光镜下观察，正常角膜组织上皮细胞层、基质层、内皮细胞层各层结构清晰完整(见图1);烧伤后1 d，角膜缘可见炎性细胞浸润，角膜上皮细胞层部分脱落(见图2);烧伤后4 d，炎性细胞浸润增多，并向角膜中央及深部扩展，浅基质层可见散在的新生血管，基质层水肿，胶原纤维紊乱(见图3);烧伤后7 d炎性细胞浸润进一步增多，基质层可见大量新生血管，其管腔由单层内皮细胞围成，有些新生血管腔内充满红细胞，基质胶原纤维排列紊乱(见图4);烧伤后14 d，炎性细胞浸润减轻，成纤维细胞增多，新生血管出现纤维化(见图5);烧伤后21 d，新生血管和炎性细胞均显著减少，角膜基质层结构逐渐趋向整齐(见图6)。

　　2.2 MVD记数

　　结果显示，在CNV形成中，MVD数量逐渐增加，以CNV 7 d组MVD数最多，此后逐渐减少(见表1)。表1大鼠角膜碱烧伤后不同阶段角膜中MVD记数

　　2.3 免疫组化检测VEGF的表达

　　免疫组化检测显示：对照组大鼠角膜组织结构正常，可见角膜上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层、内皮层排列整齐，VEGF 在角膜中均有阳性表达，碱烧伤后1天，角膜上皮受损，角膜缘血管网可见炎性细胞增多，在这些炎性细胞周围，VEGF呈弱阳性表达，整个过程中，VEGF表达缓慢增高，从角膜缘至角膜中央的VEGF表达逐渐增加;到7～14天时VEGF分布于整个血管化的角膜，这些表达亦位于炎性细胞周围;21天后，VEGF在萎缩的角膜表达很弱(见表2)。表2大鼠角膜碱烧伤不同阶段角膜中VEGF 的平均光密度 (

　　2.4 图像分析结果

　　免疫组化计算机图像分析检VEGF阳性细胞的平均光密度，其各时段均值变化情况见表2, CNV中VEGF与MVD的关系见表3。表3MVD与CNV中VEGF 的关系

　　3 讨论

　　目前研究表明，现已纯化出的许多多肽类因子，均与新生血管的生长有关。其中VEGF是惟一作用于血管内皮细胞的生长因子，有很强的促进血管内皮细胞分裂、增殖、迁移和增强血管通透性的作用，并且VEGF受体广泛存在于血管内皮细胞中。因此，VEGF作为与病理过程相关的内源性血管生成因子，对角膜新生血管的生成有促进作用。正常角膜中，VEGF在上皮、内皮以及角膜缘血管内皮细胞上均有表达，其受体flt-1和flk-1在角膜缘血管内皮细胞上有表达[2]。在多种原因引起的角膜新生血管中，VEGF mRNA及其蛋白在浸润的白细胞、新生血管内皮细胞上表达明显升高[3, 4]。VEGF的作用在于它可以刺激内皮细胞分泌蛋白酶和蛋白酶原活化因子，从而导致血管基底膜的降解，细胞得以侵入周围基质，迁移，增生，最终分化成一个新的、含有一个空腔的血管[5]。腾旭等[6]研究发现，VEGF mRNA水平的升高、下降和角膜新生血管的面积变化是相对应的，但峰值提前48 h，而我们在该研究中发现，大鼠角膜碱烧伤后，VEGF的表达增加较新生血管的出现早24 h。Amano等[7]发现在鼠角膜新生血管模型中VEGF mRNA及其蛋白水平增高，证实VEGF是一个有效的内源性角膜血管因子。而且，VEGF是新确定的一种具有特异性可促进血管内皮细胞分裂、在新生血管的形成过程中发挥中心作用的因子[8]。Cursiefen等[9]对2557个扣状角膜的病理研究发现，导致血管化瘢痕的全部角膜均呈现VEGF免疫组化染色阳性。据此认为，VEGF与病理性的角膜血管形成有关。

　　本实验中，在角膜新生血管形成的早期阶段，VEGF在角膜缘区表达增加，此后与新生血管的形成相一致，VEGF的表达逐渐增加并朝向角膜中央，且VEGF表达位于炎性细胞浸润的部位，表明VEGF的表达与炎性细胞关系密切。 Edelman等[3]在相同的动物模型中证实化学烧伤后角膜VEGF的主要来源是从角膜缘侵入角膜基质层的白细胞，本实验中也观察到同样结果。由此，进一步证实了VEGF对血管内皮细胞有特异的促有丝分裂作用，是有效的内源性角膜血管生长因子，VEGF在角膜碱烧伤后新生血管形成中起着关键作用。

　　本实验中，MVD与VEGF 的表达呈正相关，其相关系数为r =0.999, P=0.000 (P<0.01)，表明在角膜新生血管形成中随着MVD的增加，VEGF的表达也逐渐增强。Kurizaki T等[10]通过分析研究VEGF和MVD的表达情况，认为MVD与VEGF的表达有相关性。因此，有针对性地干预碱烧伤后角膜组织VEGF的表达，就可以有效抑制新生血管的生长，尤其是碱烧伤后前7d及时有效的干预更为重要。另外，我们也发现，VEGF也表达在正常角膜组织的上皮及内皮细胞中，据此研究者推测，VEGF除目前已知的功能外，可能还有参与维持正常角膜组织生理功能和角膜损伤愈合功能[11]。在治疗角膜新生血管化时，不能完全抑制VEGF。

　　总之，碱烧伤后鼠角膜VEGF的表达水平与新生血管的形成有明显的相关性，并在其中发挥了重要作用。靶向VEGF的干预治疗应该是今后眼部新生血管性疾病治疗的主要选择途径之一。

　　【参考文献】

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　　[10] Kurizaki T,Toi M,Tominaga T.Relationship between matrix metalloproteinase expression and tumor angiogenesis in human breast carcinoma [J].Oncol Rep,1998,5(3):673-677

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