组织工程角膜支架材料研究现状

作者：房兴峰　赵靖　谢立信作者单位：山东省眼科研究所，山东 青岛 ２６６０７１ 【摘要】支架材料是组织工程角膜的土壤，土壤微环境的好坏（即支架材料的选择）直接关系到组织工程角膜的构建及其应用。选择具有更高生物活性、透明性、机械强度等特点的支架材料是组织工程角膜研究的热点，本文就支架材料的研究现状做一综述。 【关键词】  组织工程；角膜；支架材料　　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］  A scaffold structure is the basic requirement for constructing a tissue-engineered cornea. The construction and application of a tissue-engineered cornea is determined by the properties of the carrier. Although all areas of tissue-engineering corneal research are important, the carrier is the primary focus. The goal is to choose carrier materials with more bioactivity, more transparency, and better mechanical strength properties. This article reviews our experience in the modification of scaffold materials and the creation of new scaffold materials.    ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］   ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； ｃｏｒｎｅａ； ｓｃａｆｆｏｌｄ　　由于临床角膜供体的缺乏和移植排斥反应的存在，组织工程角膜学科应运而生。它是组织工程学的一个分支，支架材料是基础，为角膜各层细胞的生长增殖提供三维空间和新陈代谢的环境，并决定新生组织的大小、形状和生物学性质等。只有选择了良好的支架材料，种子细胞在优越的、肥沃的土壤环境中才能良好生长增殖，构建的组织工程角膜生物活性高，符合正常角膜的生理特性。Ｔｅｒａｄａ等［１］描述了组织工程支架材料的基本特征：具有一定的生物降解速度、良好的生物相容性和细胞亲和性、一定的力学性能、特定的三维孔结构，能灭菌消毒，可以含有能控制释放的生长因子。而组织工程角膜支架材料还应同时具有一定的透明性、屈光力，对光线散射作用小，可以使光线透过并屈折成像等特性。目前没有一种材料能完全具备这些特征，因此组织工程角膜支架材料仍是当前研究的热点。    组织工程角膜支架材料主要分三大类：天然材料，人工材料，复合材料。    １  天然材料    １.１  羊膜  羊膜是胎盘膜的内层、呈半透明的膜样组织，是人体最厚的一层基底膜，共分五层，由内向外依次是上皮细胞层、基底膜、实质层、纤维母细胞层和海绵层，而经过处理的羊膜仅有基底膜和实质层，无抗原性，具有碱性成纤维细胞生长因子等生长因子，具有ＩＶ和Ｖ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白和各种整合蛋白，可以提供细胞生长所需要的物质，促进细胞的黏附、分化和生长增殖；还具有抑制炎症反应的作用。羊膜作为组织工程化角膜上皮细胞的载体，已经应用于临床治疗眼表疾病并取得了一定的成效［２］。Ｋｏｉｚｕｍｉ等［３］以羊膜为基质培养兔正常眼角膜缘干细胞，１４ ｄ融合；继续培养１个月，将其自体移植于眼表损伤的患眼，５ ｄ内患眼角膜完全上皮化并与结膜上皮相连。Ishino等［４］以羊膜为支架培养人角膜内皮细胞，将其移植于去除后弹力层和内皮细胞层的兔角膜的裸露基质面，人角膜内皮细胞可以成活并保持功能和大体形态。Ｅｓｐａｎａ等［５］以羊膜为载体培养人角膜基质细胞，在原代和传代培养过程中基质细胞能保持树枝状的形态和出现细胞间的拉网现象，经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和ＲＴ－ＰＣＲ检测，基质细胞体外表达角膜蛋白多糖ｋｅｒａｔｏｃａｎ。羊膜具备来源广、制备成本低等优点，是一种较成熟的组织工程支架材料，但是有传播疾病的潜在危险和处理不当引起羊膜损坏的可能。因此，我们应当：?譹?訛严格规范羊膜的来源，确保来源于健康产妇。?譺?訛探索更好的羊膜制备和保存方法，确保在此过程中不受损坏，更好地保存其生物活性。?譻?訛对以其为支架构建三层细胞的组织工程角膜作进一步研究。

 １.２  胶原  胶原是从动物骨骼和筋膜等中提取出来的，具有抗原性低、生物相容性好等优点，是一种由三条肽链以右手螺旋交织在一起的参与组织愈合的纤维状糖蛋白。１９９３年日本Ｍｉｎａｍｉ等［６］通过体外分离、培养牛角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞，建立角膜三层细胞系，以三维胶原凝胶系统为支架，体外重建牛角膜三层结构，经组织学、免疫组织化学、生物学和电子显微镜检测，组织结构与正常牛角膜相似。不过胶原基质较软、韧性张力小、在体内代谢降解快、透明性差的缺点限制了其应用。目前提高其生物学特性的方法有：?譹?訛物理和化学交联。?譺?訛和其他材料混合成复合材料。?譻?訛胶原材料的修饰和改性。这几种方法能在一定程度上提高胶原的某些性能，但是可能带入有害物质（如交联剂），因此，还需寻求更好的手段和方法。    １.３  角膜基质  天然的角膜基质内存在多种生长因子，特别是角膜基质细胞可以为角膜上皮和内皮细胞提供营养。Ａｍａｎｏ等［７~９］在２００２年及以后的研究中，以猪角膜基质为支架材料接种人角膜内皮细胞获得成功，平均细胞密度为１７２１个／ｍｍ２，其Ｎａ＋－Ｋ＋泵功能相当于正常角膜内皮Ｎａ＋－Ｋ＋泵功能的６０％。用免疫组织化学方法检测猪角膜基质α－ｇａｌ抗原决定簇表达较少，植入猕猴角膜基质囊袋中，未引起急性排斥反应，只有慢性排斥反应细胞浸润。在６只受试眼中，仅有２眼出现角膜混浊并检测到ＣＤ８＋、ＨＡＭ５６＋细胞存在于猪角膜基质中，ＣＤ４＋、ＨＡＭ５６＋和巨噬细胞黏附于猕猴角膜内皮上。又将培养的人角膜内皮细胞悬液２ｍｌ（２×１０５／ｍｌ）接种于去除角膜内皮细胞的人角膜基质的内皮面，放入２４孔培养板中，以１７６ ｇ的离心力离心１０ ｍｉｎ，增加细胞与后弹力层间的黏附，人角膜内皮细胞在人角膜基质内皮面贴壁生长，大小形态一致；细胞间形成紧密连接，与正常角膜内皮细胞的紧密连接相似；细胞密度为（２３８０±２６４）个／ｍｍ２，是正常角膜内皮细胞密度的８０％；基质与内皮间的电位（０.３±０.０７）ｍＶ，与正常人角膜基质与内皮间的电位（０.４±０.１４）ｍＶ不同；Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰ酶的功能仅为正常角膜内皮的５５％～７５％。罗小玲等［１０］研究发现异种角膜基质抗原性低，生物相容性好，并以深低温冻存和甘油脱水保存的猪角膜后弹力层／基质为支架培养兔角膜内皮细胞，细胞密度达（３６２０±１１０.２３）个／ｍｍ２，呈近似六边形，表面有微绒毛，并表达神经纤维丝蛋白。吴静等［１１］用冻存的方法去除角膜细胞，但是基质胶原排列较紊乱，抗原性与新鲜角膜基质无显著差异。异种角膜基质来源丰富，抗原性低，符合角膜的生理特性，但是潜在的移植排斥反应不能完全排除。因此，探索一种良好的脱细胞、去抗原并能保持角膜胶原纤维生理特性和生物活性的方法是解决问题的关键。    １.４  壳聚糖  壳聚糖是一种新型的生物工程材料，生物学特性优良，具有较好的生物相容性和生物可降解性，无毒、无刺激、无抗原性，可促进生长因子的合成，可以作为生长因子释放的载体，具有抑制纤维细胞生长、促进上皮细胞生长的作用，已广泛应用于医学科学的各个领域。Di等［１２］将壳聚糖制成的氧氟沙星缓释剂放于兔结膜下，未发现结膜充血、角膜水肿等现象，对角膜内皮细胞的活性、晶状体上皮细胞和视网膜细胞组织形态学无明显影响，证明了它与眼部组织具有良好的生物相容性。用冻干的方法可将其制成相互连接的多孔支架，但是张力强度差，透明性低，尚需对其力学特性、透明度和降解过程等进一步探讨。    总之，天然材料具有优良的生物学特性，如生物相容性、生物可降解性、无毒、无致热原、无刺激、无（或低）抗原性和无有害降解产物等，但是它们均有不足之处，不能满足组织工程角膜支架材料的要求，还需进一步研究提高其性能。  ２  人工材料    ２.１  聚羟基乙酸   聚羟基乙酸是一种组织相容性好、可降解的合成材料，该材料的降解速度、超微结构的稳定性和强度可以在一定范围内调节。胡小洁等［１３］以兔角膜基质细胞为种子细胞，以聚羟基乙酸为支架培养的角膜基质细胞植入兔角膜基质囊袋内，在兔体内成功培养成大体外观、组织结构、生化组成与正常兔角膜基质相似的角膜基质，并发现新生组织的酸性强于周围组织，估计可能是其降解产物引起的。    ２.２  合成胶原   合成胶原是通过人工的方法合成的胶原共聚物，具有优良的生物相容性和可调的张力强度，光学透明性高。Ｌｉ等［１４］将合成胶原板层移植于活体角膜上，允许上皮细胞在其上良好生长，受体角膜基质细胞和神经纤维长入其中，在生理条件下其透明度优于人角膜。Ｇｒｉｆｆｉｔｈ等［１５］用合成胶原制成的角膜模型为供体，板层移植于猪角膜植床上，术后４ ｄ可以看见上皮细胞向移植物表面长入，３周时上皮细胞呈复层结构，共焦显微镜下可见角膜基质细胞和神经纤维长入移植物，术后３周和６周病理组织学显示层间有微小的间隙，６周时可见大量角膜基质细胞和神经纤维长入其中，知觉测试恢复到术前状态。    人工材料是人工合成的高分子物质，有较好的生物相容性和可调节的力学特性，可以发生非酶性水解，但是亲水性较差，体内代谢过程不完全清楚，可引起炎症反应、局部酸性产物堆积等，要作为组织工程角膜的支架材料，还需要深入研究。

    ３  复合材料

    ３.１  胶原和硫酸软骨素  １９９９年Ｇｒｉｆｆｉｔｈ等［１６］利用转基因技术将ＨＰＶ的癌基因转入人角膜上皮、基质和内皮细胞，构建角膜永生细胞系为种子细胞；以胶原蛋白和硫酸软骨素为材料，用戊二醛交联的复合物为支架，在体外构建了大体形态、透明性和组织结构与正常人角膜相似的组织工程角膜。Ｄｏｉｌｌｏｎ等［１７］应用小牛皮或鼠尾腱提取的Ｉ型胶原和硫酸软骨素混和，加入戊二醛交联，然后加入角膜基质细胞悬液，在接种或不接种上皮、内皮细胞的两种情况下，培养出角膜基质。戊二醛交联增加了其张力强度，硫酸软骨素的加入增加了其透明性。

    ３.２  聚乳酸和聚羟基乙酸   Ｈａｄｌｏｃｋ等［１８］以聚乳酸和聚羟基乙酸（８５：１５）共聚复合物为载体培养兔角膜内皮细胞，在细胞融合时计数单层内皮细胞密度为（２６５０±１６４）个／ｍｍ２，免疫组化检测到角膜内皮细胞间紧密连接ＺＯ－１和各细胞的边界。聚乳酸的加入减慢了聚羟基乙酸的降解速度，使支架的降解速度和基质的生成速度趋于同步，同时增强了聚羟基乙酸的韧性。

    ３.３  胶原和羊膜  Ａｈｎ等［１９］将胶原基质贴敷于羊膜基质面制成羊膜胶原支架，然后将角膜基质细胞接种于胶原基质内，培养６ ｄ后将角膜上皮细胞接种于羊膜面上培养，在此支架上成功地重建板层生物角膜，大体形态和蛋白质表达与正常角膜相似，并证实此培养物可以用来治疗角膜严重损害的患者。

    ３.４  胶原和壳聚糖  由于壳聚糖带正电荷而胶原带负电荷，两者除了以氨基和羟基结合外，还以静电引力相结合，增加了其稳定性，弥补了壳聚糖强度不高的缺陷，增加了胶原的组织相容性。丁勇等［２０］用兔角膜基质细胞作为种子细胞，以壳聚糖、胶原复合物为支架材料体外原代培养出角膜基质细胞，免疫组化检测波形蛋白，胞浆染色阳性，显示了此复合物的生物学特性。

    ３.５  胶原、壳聚糖和透明质酸钠   Ｃｈｅｎ等［２１］将胶原、壳聚糖、透明质酸钠形成的复合物植入兔角膜基质囊袋中，发现其生物相容性好，基质水肿和炎症反应相当弱，５个月后能在角膜内降解和吸收，角膜呈透明或半透明。用它作支架培养兔原代角膜缘上皮细胞、内皮细胞和基质细胞，三层细胞可以在此复合物上贴壁生长并显示生物学特性。

 复合材料是用两种或两种以上的天然和／或人工材料混合相互作用而形成的材料，它们并不是简单地混合在一起，而是各组成材料相互作用保持一定的亲和力，最大限度地优化各组成材料的优点，同时增加了新特性，从而达到扬长避短、优势互补的目的。但是各组成材料的组成比例、混合方法、复合物的理化性质和生物相容性等还需要进一步研究。

    ４  无支架培养

    Ｎｉｓｈｉｄａ等［２２］应用丝裂霉素Ｃ处理的ＮＩＨ３Ｔ３作饲细胞，在温度敏感培养皿上于３７℃培养兔角膜缘上皮干细胞，２周后将温度降到２０℃，使培养的上皮细胞层与培养皿分离，取出上皮细胞层，自体移植于实验诱导角膜缘干细胞缺乏的兔角膜基质上，成功重建兔眼表，角膜保持透明。Ｉｄｅ等［２３］在温度敏感培养皿上培养出单层的人角膜内皮细胞，与正常人角膜内皮细胞相似，呈六边形，有丰富的微绒毛和细胞器，免疫荧光检测到细胞的基质面Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白等细胞外基质；免疫荧光和免疫印迹显示在细胞层与培养皿分离前后的内皮细胞间存在ＺＯ－１。这种方法培养出的单细胞层缺乏张力，不适于缝合，要构建成三维组织工程角膜，还需要长期细致的研究，但是作为组织工程角膜构建的一条崭新思路，其具有重大的意义。

    ５  结语

    组织工程角膜经过十余年的发展，支架材料的研究取得了巨大的突破，但是仍没有一种材料可以完全满足组织工程角膜支架材料的要求，存在不少问题：?譹?訛支架材料的力学强度和光学性能。?譺?訛支架材料角膜外形和曲率的构建。?譻?訛支架材料的三维孔构建。?譼?訛支架材料的降解和基质的生成是否同步，降解产物的性质和去向。?譽?訛支架材料的安全性和植入后的长期效应等。随着细胞和分子生物学、生物材料学、组织工程技术学等基础研究新成果的出现、研究方法的完善，组织工程角膜支架材料的研究进一步向前推进。总体来讲，复合材料和角膜去细胞基质是目前研究的热点，有望成为良好的组织工程角膜支架材料，为组织工程角膜的构建解决难题。