氯离子通道阻滞剂对人眼小梁细胞吞噬作用的影响

　　作者：梁巍 郑雅娟 作者单位：吉林大学第二医院眼科，吉林 长春 130041)

　　【摘要】 目的 探讨氯离子通道阻滞剂—5硝基2(3苯丙胺)苯甲酸〔5nitro2(3phenylpropylamino)benzoic acid,NPPB〕对人眼小梁细胞吞噬功能的影响。方法 培养人眼小梁细胞，对其进行免疫化学染色鉴定，采用RTPCR技术检测小梁细胞CLC2 mRNA的表达，然后应用流式细胞仪定量检测不同浓度NPPB作用下，小梁细胞对乳胶株的吞噬指数。结果 体外培养的人眼小梁细胞NES染色阳性，且成功检测出CLC2 mRNA 表达。当加入10 μmol/L的NPPB作用6 h后，小梁细胞对乳胶株的吞噬指数与对照组相比无明显改变(P>0.05)，而50 μmol/L的NPPB作用后，小梁细胞对乳胶株的吞噬作用明显降低(P<0.01)，低于对照组，且随着加入NPPB浓度的增加，吞噬指数逐渐降低。结论 氯离子通道阻滞剂浓度依赖的抑制小梁细胞的吞噬功能,且氯离子通道CLC2可能参与调节小梁细胞吞噬过程。

　　【关键词】 5硝基2(3苯丙胺)苯甲酸;小梁细胞;吞噬

　　Effect of chloride channel inhibitor in phagocytic process of human trabecular meshwork cellsLIANG Wei, ZHENG YaJuan.Department of Ophthalmology, the Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, Jilin, China【Abstract】 Objective To investigate the effect of chloride channel inhibitor 5nitro2(3phenylpropylamino)benzoic acid(NPPB) on cultured human trabecular meshwork cells phagocytic process. Methods Cultured human trabecular meshwork cells was assessed by immunochemistry and the expression of CLC2 mRNA in cultured human trabecular meshwork cells was detected with RTPCR. Then, flow cytometry was performed to detect the phagocytic index on cultured human trabecular meshwork cells which had been pretreated by chloride channel inhibitor NPPB. Results Immunohistochemical staining of the cultured human trabecular meshwork cells which was detected the expression of CLC2 mRNA was positive. Compared with that of control group, 10 μmol/L NPPB didn′t affect the phagocytic process of the trabecular meshwork cells(P>0.05), however when treated with 50, 100 and 500 μmol/L DNDS, the phagocytic indexes were significantly decreased(P<0.01),and as the concentration were increased, the phagocytic indexes was decreased gradually. Conclusions The trabecular meshwork cell′s phagocytic process is affected by a certain concentration of NPPB and chloride channel CLC2 may be play important roles in the phagocytic process of trabecular meshwork cells.

　　【Key words】 NPPB; Trabecular meshwork cells; Phagocytosis

　　原发性开角型青光眼(POAG)是一种常见的致盲眼病，小梁网细胞外基质的异常沉积以及小梁细胞吞噬功能的异常可能是导致房水外流阻力增加的重要因素〔1〕。目前国内外对小梁细胞吞噬机制的研究颇为关注，但未见关于氯离子通道CLC2对小梁细胞吞噬能力影响的相关报道。本研究旨在探讨氯离子通道CLC2在小梁细胞吞噬过程中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞、培养液、主要生化试剂及实验仪器 永生株人眼小梁细胞(中山大学眼科中心卓业鸿教授惠赠);DMEM/F12培养液、磷酸缓冲液(PBS)和胎牛血清(Gibco公司);荧光标记的乳胶株(Molecular probes);NPPB(美国Sigma公司);RTPCR试剂盒及引物(Invitrogen);MillicellHA Culture Plate Inserts(Bedford公司);6孔培养板(IWAKI);离心机(日立);CO2恒温细胞培养箱(SANYO);倒置相差显微镜(OLYMPUS)，ELITE型流式细胞仪(Coulter公司)。

　　1.2 人眼小梁细胞体外培养 用含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养小梁细胞，置于37℃、5% CO2孵箱内培养，每2～3 d换液1次，视细胞生长情况使用0.25%胰蛋白酶消化后，以1∶4～1∶5的比例传代，传至3～4代细胞生长均匀一致，近融合数量恒定后，进行实验。

　　1.3 RTPCR检测人眼小梁细胞上氯离子通道CLC2 mRNA的表达 提取培养的永生株人眼小梁细胞总RNA(具体步骤参照试剂盒)，以RNA为模板，逆转录方式获得cDNA，反应产物行PCR扩增。上游引物：5′GCTGTCATTGGTATTGCTAGTGG3′;下游引物：5′AGCGTCTCTTTCTGTGAGAGCTGT3′。扩增条件：94℃预变性5 min，再进行30个循环，每个循环包括：94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸10 min，冷却到4℃。最后琼脂糖凝胶电泳观察。

　　1.4 人眼小梁细胞吞噬荧光包被乳胶株吞噬模型的建立 将小梁细胞接种至6孔培养皿中(2.5×105个细胞/孔)培养48 h，此时细胞生长融合达培养皿的70%～90%。将荧光标记的乳胶株以PBS稀释至5×107个乳胶株/ml，再与FN混合，使FN最终浓度1.0 μg/ml，37℃孵育6 h后取出，使用0.25%胰蛋白酶消化，分散细胞，以PBS洗涤3次后，将每个培养皿中的待检测细胞以0.5 ml PBS重悬，去除细胞外黏附的大部分乳胶株〔5〕。采用流式细胞仪定量检测人眼小梁细胞对乳胶株的吞噬指数，以吞噬指数的高低反映人眼小梁细胞的吞噬能力。激发光波长488 nm，发射光波长(530±15)nm，每个样品计数10 000个细胞，将已吞噬乳胶株的细胞所占全部分析细胞的百分比为定为吞噬指数。

　　1.5 流式细胞仪检测不同浓度氯离子通道阻滞剂(NPPB)作用后小梁细胞吞噬指数 在细胞培养液内加入10、50、100和500 μmol/L的NPPB，对细胞预处理1 h后加入荧光包被的乳胶株，于37℃孵箱内孵育6 h，消化、分散细胞后行流式细胞仪检测。将未加入NPPB的设立为对照组。

　　1.6 统计学处理 应用SPSS 11.0软件进行数据分析，各组吞噬指数以x±s表示，组间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 电镜下永生株人眼小梁细胞形态 图1为正常电镜下永生株人眼小梁细胞形态。

　　图1 永生株人眼小梁细胞(×100)2.2 RTPCR结果 培养的永生株人眼小梁细胞电泳结果显示为一条位置为218 bp的特异性条带，这表明CLC2在人眼小梁细胞上的表达，见图2。

　　图2 永生株人眼小梁细胞上CLC2 mRNA表达

　　2.3 不同浓度NPPB作用后RPE细胞吞噬乳胶株的吞噬指数 图4分别显示不同浓度(0、10、50、100、500 μmol/L)NPPB作用于小梁细胞后，流式细胞仪检测小梁细胞对乳胶株的吞噬指数。第1个峰表示未吞噬乳胶株的细胞，第2个峰表示吞噬乳胶株的细胞。未加入NPPB的对照组吞噬指数为(36.3±3.1)%。加入10 μmol/L的NPPB，小梁细胞对乳胶株的吞噬指数〔(29.1±2.3)%〕与对照组相比无明显改变(P>0.05)，而50 μmol/L NPPB作用后，小梁细胞对乳胶株的吞噬作用明显降低〔吞噬指数为(17.4±3.1)%〕(P<0.01)，低于对照组，且随着浓度的增加，吞噬指数逐渐降低〔100、500 μmol/L的吞噬指数分别为(14.3±2.2)%和(9.0±1.8)%〕。表明小梁细胞在一定浓度NPPB作用后，对乳胶株的吞噬作用明显降低，且这种抑制作用具有浓度依赖性。

　　图3 NPPB作用后小梁细胞吞噬乳胶株时的吞噬指数

　　3 讨 论

　　小梁细胞作为小梁网的内皮细胞，其吞噬功能的下降及细胞外基质的异常沉积，必将引起房水外流受阻及眼内压升高，导致POAG的发生发展。由于人眼小梁细胞来源、取材困难，所以本实验采用永生株人眼小梁细胞。

　　氯离子是生物体内最多的阴离子，广泛分布于哺乳动物的组织器官和各种细胞中，在维持细胞的容积平衡、调节细胞内pH值、细胞迁移、细胞增生分化、细胞免疫应答等多种生理、病理过程中发挥重要作用〔2，3〕。作为氯离子通道中一种,目前CLC2被认为主要分布于细胞质膜上，主要参与调节细胞体积及氯离子内流〔4〕。氯离子通道阻滞剂NPPB属芳香族酸类容量敏感性氯通道阻滞剂，微摩尔剂量即可产生抑制作用，对CLC2等多种氯离子通道均有阻断作用〔5〕。本实验通过RTPCR的方法成功检测到小梁细胞上CLC2 mRNA的表达。

　　小梁细胞吞噬功能受多种因素影响，而笔者前期实验已经证实CLC2可以调节视网膜色素上皮细胞的吞噬功能，所以推测CLC2对小梁细胞的吞噬功能也会发挥某种程度的调节作用。为证实上述可能性，本研究通过建立小梁细胞吞噬荧光包被乳胶株模型，并利用氯离子通道阻滞剂NPPB，观察小梁细胞上氯离子通道CLC2在小梁细胞吞噬过程中的作用。本研究结果显示，随着NPPB浓度的增高，小梁细胞对乳胶株的吞噬指数逐渐降低，与对照组相比具有统计学意义，这表明调节小梁细胞的吞噬功能可能是氯离子通道CLC2参与POAG发生、发展的重要途径之一，但具体调节作用经过何种途径达到尚需大量后续实验研究。

　　本研究认为氯离子通道通过改变细胞电位变化、调节细胞体积等途径影响小梁细胞的吞噬功能。但小梁细胞吞噬能力是一个受多种因素控制的极为复杂的过程，其发挥作用的确切机制尚不清楚，有待于进一步研究，以期待为临床治疗POAG提供新的思路。

　　【参考文献】

　　1 Zhang L,Xu L,Yang H.Risk factors and the progress of primary openangle glaucoma〔J〕.zhonghua Yan Ke Za Zhi,2009;45(4):3804.

　　2 Jentsch TJ,Stein V,Weinreich F.Molecular structure and physiological function of chloride channels〔J〕.Physiol Rev，2002;82(2):50368.

　　3 Comes N,Gasull X,Gual A,et al.Differential expression of the human chloride channel genes in the trabecular meshwork under stress conditions〔J〕.Exp Eye Res,2005;80(2):80113.

　　4 Comes N,Abad E,Morales M,et al.Identification and functional characterization of ClC2 chloride channels in trabecular meshwork cells〔J〕. Exp Eye Res,2006;83(2):87789.

　　5 Zhang GP,Shi Y.Progress in the study of background chloride channels〔J〕.Prog Biochem Biophys,1998;25(4):3248.