葡萄膜炎患者外周血单个核细胞TLR9、TLR7 mRNA的表达及意义

　　作者：丁歆，付琳琳，苏稚辉，刘钢，方桂英 作者单位：1.东南大学医学院附属徐州市中心医院眼科,江苏徐州221009;2.徐州医学院病原微生物学教研室，江苏徐州 221002

　　【摘要】 目的 观察葡萄膜炎患者外周血单个核细胞(PBMCs)Toll样受体9(TLR9)、Toll样受体7(TLR7)mRNA的表达。方法 收集42例葡萄膜炎患者(其中发病与感染相关者12例,与感染无关者30例)和正常对照组(30例)外周血,采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离PBMCs,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测PBMCs TLR9、TLR7 mRNA表达的相对含量。结果 与感染相关葡萄膜炎患者PBMCs TLR9、TLR7 mRNA相对含量显著高于与感染无关葡萄膜炎患者和正常对照组(P<0.01)，与感染无关葡萄膜炎患者与正常对照组比较TLR9、TLR7 mRNA相对含量差异无统计学意义(P>0.05)。结论 TLR9、TLR97的表达在与感染相关葡萄膜炎患者中显著升高,提示感染因素在葡萄膜炎中的作用可能通过TLR9、TLR7介导。

　　【关键词】 葡萄膜炎;外周血单个核细胞;TLR9;TLR7

　　Expression of TLR9 mRNA and TLR7 mRNA in peripheral blood mononuclear cells of patients with uveitis

　　DING Xin, FU Linlin, SU Zhihui, LIU Gang, FANG Guiying

　　1.Department of Ophthalmology, Affiliated Xuzhou Central Hospital, Southeast University School of Medicine, Xuzhou,Jiangsu 221009, China;

　　2. Department of Pathogenic Microbiology, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002

　　Abstract: Objective To investigate the expression of TLR9 and TLR7 mRNA of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in patients with uveitis. Methods Peripheral blood was collected from 42 uveitis patients (12 patients with or related to infection and 30 patients without) and 30 healthy individuals as controls. PBMCs were isolated by Ficoll-Hypaque gradient centrifugation. RT-PCR was adopted to determine the relative content of the expression of TLR9 mRNA and TLR7 mRNA of the PBMCs. Results The relative content of expression of TLR9 mRNA and TLR7 mRNA were significantly upregulated in the patients related to infection compared with that of patients unrelated and controls (P<0.01). There was no statistic significance for the differences in the content of expression of TLR9 mRNA and TLR7 mRNA between patients unrelated to infection and healthy controls (P>0.05). Conclusion The upregulated expression of TLR9 mRNA and TLR7 mRNA in uveitis patients associated with infection indicates that infective factors might be mediated by TLR9 and TLR7.

　　Key words: uveitis; peripheral blood mononuclear cells; TLR9; TLR7

　　葡萄膜炎是一种T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病，多发生于青壮年，易反复发作，治疗棘手，为致盲的主要原因之一。近年的研究表明，Th1型免疫反应在葡萄膜炎中起主导作用[1]。Toll样受体( Toll-like receptors, TLRs)是近年来备受关注的一种细胞表面信号传导跨膜受体，在识别细菌等病原微生物及介导的炎症反应信号通路中有重要作用，其表达异常与自身免疫性疾病关系密切[2]。TLR9 是TLRs家族中的重要一员，通过识别侵入机体的病毒和细菌中未甲基化CpG基序使免疫应答倾向于Th1型反应，TLR7识别病毒单链RNA，协同TLR9信号通路[3]。本研究初步观察了与感染相关及无关葡萄膜炎患者和正常对照组外周血单个核细胞(PBMCs)TLR9、TLR7 mRNA表达情况。

　　1 资料和方法

　　1.1 一般资料和分组

　　42例葡萄膜炎患者选自东南大学附属徐州市中心医院眼科门诊及住院患者,经专科检查，诊断明确，包括前葡萄膜炎28例，后葡萄膜炎6例，全葡萄膜炎8例。年龄为9～61岁，平均(27.0±1.6)岁。其中明确发病与感染有关者(与感染相关组)共12例，与感染无关者(与感染无关组)30例。检测前,患者至少1个月内未接受糖皮质激素、免疫抑制剂或具有免疫调节作用的药物治疗。健康志愿者30例为对照组，年龄为8～60岁，平均(29.0±1.8)岁。

　　1.2 主要试剂

　　人淋巴细胞分离液、Ficoll Taq DNA聚合酶(北京鼎国生物技术有限公司),DEPC(Sigma公司),Trizol试剂(Intrivogen公司),Rever Tra Ace逆转录酶(TOYOBO生物科技公司)。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 PBMCs的分离

　　抽取研究对象清晨空腹静脉血15 ml,Ficoll法分离PBMCs。

　　1.3.2 PBMCs总RNA的提取

　　用Trizol-氯仿-异丙醇-乙醇法提取PBMCs总RNA。

　　1.3.3 RT-PCR检测TLR9、TLR7表达

　　1.3.3.1 逆转录反应合成cDNA

　　取RNA 1 μg加入oligo T 1 μl,5×Buffer 4 μl,10 mmol/L dNTP 2 μl,RNA酶抑制剂1 μl,DEPC水加至20 μl。反应条件：42℃ 20 min，99℃ 5 min,4℃ 5 min。

　　1.3.3.2 PCR检测TLR9、TLR7 mRNA表达相对含量

　　TLR9、TLR7、GAPDH的引物序列设计应用在线引物设计软件Primer 3.0，由上海博亚生有限公司合成。具体序列见表1。扩增体系及反应条件:取2 μl cDNA,5 μl 10×PCR Buffer,2 μl dNTPs,上游、下游引物各2 μl、1 μl Taq酶,加灭菌双蒸水至总体积50 μl;94℃ 5 min预变性,94℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,共30个循环,72℃延伸10 min。PCR扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳,采用凝胶成像分析系统中进行图像分析。以GAPDH为内参照半定量,各样本表达强度=样本灰度值/GAPDH灰度值。表1 TLR9、TLR7和GAPDH引物序列(略)

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS 11.5软件进行统计学处理，所有计量资料均以±s表示。各组间数据比较采用方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　与感染相关葡萄膜炎患者PBMCs TLR9、TLR97 mRNA的平均表达水平明显高于与感染无关葡萄膜炎患者和正常对照组(P<0.01);而与感染无关葡萄膜炎患者和正常对照组PBMCs TLR9、TLR97 mRNA平均表达水平无明显差异(P>0.05)。见表2。

　　表2 葡萄膜炎患者和正常对照组PBMCs TLR9、TLR7 mRNA表达的比较(略)

　　3 讨 论

　　TLRs是近几年发现的一类天然免疫受体，分布十分广泛，主要表达于免疫效应细胞如单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞等，它能选择性地识别侵入机体的病原微生物所携带的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),并引发一系列信号转导，进而导致炎性介质释放，并诱导巨噬细胞和树突状细胞的活化与成熟,产生细胞因子,导致针对病原微生物的获得性免疫应答[4]。因此,作为天然免疫系统的主要组成部分,TLRs在宿主抗感染的防御反应中扮演重要角色。研究表明，感染是部分自身免疫性疾病、过敏性疾病触发或加重的因素，作为宿主防御体系的重要参与者,TLRs的分布和功能异常亦参与了自身免疫性疾病的发病机制[5]。

　　TLR9是近年研究较多的TLRs家族成员，其配体CpG DNA是一种潜在的佐剂，可与TLR9在溶酶体小室特异性结合，通过接头蛋白MyD88途径激活转录因子NF-κB、AP-1，产生大量IL-2、IL-12和Ⅰ型干扰素(IFN),继而诱导抗原特异性的Th1细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活化、增殖，产生Th1型免疫反应，免疫反应过强时在易感机体可以促发相关自身免疫性疾病。TLR7与TLR9共同表达于内质网中,作为一个辅助受体参与TLR9介导CpG DNA激活免疫细胞。此外，研究表明，浆细胞样树突状细胞和髓细胞样树突状细胞都可以被合成的TLR7配体imiquimod和R848激活,发生从不成熟表型到成熟表型的转换,而且激活的细胞都诱导CD4+ T细胞分化为产生IFN-γ的Th1细胞，这提示TLR7可能有直接调节Th1型适应性免疫应答的能力[6]。Prinz等[7]观察了实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)TLRs表达谱的变化，发现TLR9、TLR7 mRNA在模型发病的高峰期显著升高;此外，与野生型鼠比较，TLR9基因敲除小鼠起病时间较平均起病时间明显延迟，中枢神经系统病理改变及平均行为学评分明显改善。Anders等[8]用马去铁蛋白(HAF)诱导Balb/c鼠产生免疫复合物性肾小球肾炎,再用CpG DNA刺激会加剧肾小球肾炎，表现为肾小球巨噬细胞浸润增加,MCP-1/CCL2、RANTES/CCR5、CCR1、CCR2和CCR5等趋化因子表达增加,肾间质IgG2A沉积，蛋白尿程度也更为严重。以上研究提示，TLR9、TLR7在感染触发炎症性疾病和自身免疫性疾病的发病机制中起一定作用。

　　葡萄膜炎是一组累及葡萄膜、视网膜、视网膜血管及玻璃体的炎症性病变，Th1/Th2细胞平衡的失调尤其是Th1细胞的数量增加和功能亢进可能加剧了其炎症的发生和发展。Th1/Th2细胞由Th0细胞分化而来，后者的分化主要由局部环境中的细胞因子及细胞内关键转录因子调控，如细胞因子IL-12、Ⅰ型IFN，转录因子T-bet、STAT1、STAT4、IRF1促使Th0向Th1细胞分化，细胞因子IL-4、IL-10,转录因子STAT6、IRF4和GATA-3促使Th0向Th2细胞分化。褚利群等[9]用视网膜S抗原与弗氏完全佐剂免疫大鼠诱导实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis,EAU)模型，发现EAU中虹膜、视网膜及脾脏中Th1细胞转录因子T-bet表达增加，免疫组织化学双染色显示T-bet阳性细胞是CD4+T细胞。Li等[10]对Behcet病性葡萄膜炎患者外周血和结节红斑组织的研究发现,患者PBMCs的T-bet mRNA及其蛋白表达水平均显著增高,结节红斑组织中有大量T-bet阳性细胞。Takase等[11]研究发现IFN-γ等Th1细胞因子在EAU模型视网膜表达上调，而IL-4、IL-5等Th2细胞因子表达下降。这些研究均支持葡萄膜炎是Th1细胞介导的疾病。天然免疫受体TLRs具有调节Th细胞分化的功能，如上述及TLR9活化主要诱导Th1型免疫反应，与一些自身免疫性疾病如EAE等密切相关，但其与葡萄膜炎的关系却知之甚少。

　　笔者用Ficoll法分离感染相关及无关葡萄膜炎患者PBMCs，检测了PBMCs TLR9、TLR7 mRNA表达，结果显示TLR9、TLR7 mRNA在感染相关葡萄膜炎患者PBMCs高表达,和正常对照组及感染无关患者相比差异有统计学意义，提示TLR9、TLR7参与了感染诱发葡萄膜炎的病理生理过程。其机制可能是一些易感机体在受到病毒或细菌CpG DNA刺激后，TLR9、TLR7表达上调，介导的信号通路过度活化，Th1型免疫反应过强，大量产生的Th1细胞因子在葡萄膜、视网膜等引发炎症反应导致组织损伤。对TLR9、TLR7信号通路在葡萄膜炎中的作用机制进行深入研究，或许能为葡萄膜炎的特异性治疗提供新的靶点和思路。

　　【参考文献】

　　[1]Ohta K, Wiggert B, Yamagami S, et al. Analysis of immunomodulatory activities of aqueous humor from eyes of mice with experimental autoimmune uveitis [J]. J Immunol,2000,164(3):1185-1192.

　　[2]Ishii KJ, Uematsu S, Akira S. ‘Toll’ gates for immunotherapy [J]. Curr Pharm Des,2006,12(32):4135-4142.

　　[3]Vollmer J. TLR9 in health and disease [J]. Int Rev Immunol,2006，25(3-4):155-181.

　　[4]Bafica A, Scanga CA, Feng CG, et al. TLR9 regulates Th1 responses and cooperates with TLR2 in mediating optimal resistance to Mycobacterium tuberculosis [J]. J Exp Med,2005,19,202(12):1715-1724.

　　[5]Colonna M. Toll-like receptors and IFN-alpha: partners in autoimmunity [J]. J Clin Invest,2006,116(9):2319-2322.

　　[6]Hemmi H, Kaisho T, Takeuchi O, et al. Small anti-viral compounds activate immune cells via the TLR7 MyD88-dependent signaling pathway [J]. Nat Immunol,2002,3(2):196-200.

　　[7]Prinz M, Garbe F, Schmidt H, et al. Innate immunity mediated by TLR9 modulates pathogenicity in an animal model of multiple sclerosis [J]. J Clin Invest,2006,116(2):456-464.

　　[8]Anders HJ, Banas B, Linde Y, et al. Bacterial CpG-DNA aggravates immune complex glomerulonephritis: role of TLR9-mediated expression of chemokines and chemokine receptors [J]. J Am Soc Nephrol,2003,14(2):317-326.

　　[9]褚利群,杨培增,李 兵.实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎中T-bet的表达及意义[J].中华眼底病杂志,2004,20(3):172-174.

　　[10]Li B, Yang P, Zhou H, et al. T-bet expression is upregulated in active Behcets disease [J]. Br J Ophthalmol,2003，87(10):1264-1267.

　　[11]Takase H, Yu CR, Ham DI, et al. Inflammatory processes triggered by TCR engagement or by local cytokine expression: differences in profiles of gene expression and infiltrating cell populations [J]. J Leukoc Biol,2006,80(3):538-545.