干扰CLC2基因表达对人眼小梁细胞细胞周期进程的影响
发表时间：2010-06-12 浏览次数：378次
作者：梁 巍 郑雅娟 作者单位：(吉林大学第二医院眼科，吉林 长春 130041)
【摘要】 目的 观察抑制CLC2基因的表达对人眼小梁细胞细胞周期进程的影响。方法 构建针对CLC2的小干扰(siRNA)重组表达载体，脂质体LipofectamineTM2000介导转染人眼小梁细胞后，应用RTPCR半定量检测小梁细胞CLC2 mRNA表达量的变化;流式细胞仪检测干扰CLC2表达后，人眼小梁细胞细胞周期进程。结果 与空载体组比较，重组载体组的CLC2 mRNA表达明显降低，且有效抑制小梁细胞由G0期到G1的转位。结论 抑制CLC2的表达可以干扰人眼小梁细胞正常细胞周期进程。
【关键词】 CLC2;小梁细胞;RNAi
Effect of interfered CLC2 gene expression on cell cycle of human trabecular meshwork cells
LIANG Wei, ZHENG YaJuan.
Department of Ophthalmology, the Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, Jilin, China
【Abstract】 Objective To investigate the effect of CLC2 suppression by antisense oligonucleotide on cell cycle of human trabecular meshwork cells. Methods CLC2 mRNAtargeted hairpin siRNA was designed and constructed, and transfected into cultured human trabecular meshwork cells by LipofectaminTM2000. RTPCR semiquantitative was applied to detect the expression of the cell′s CLC2 gene, and flow cytometry was performed to detect the change of cell cycle on interfered human trabecular meshwork cells. Results The expression of CLC2 gene in siRNA interfered groups was significantly lower than that of control group, and the cell cycle of siRNA interfered human trabecular meshwork cells was effectively inhibited from GO to G1 phase. Conclusions To inhibit the expression of CLC2 can effectively interfere cell cycle of the human trabecular meshwork cells.
【Key words】 CLC2; Trabecular meshwork cells; RNAi
人眼房水外流阻力主要来自于小梁网(trabecular meshwork,TM),小梁细胞作为小梁网的内皮细胞，其形态、数量及功能的异常改变，必将引起房水外流受阻，导致原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)的发生和发展〔1，2〕。根据流行病学调查，POAG多发生于50～70岁的中老年，30岁以下较少发病。氯离子通道作为一种对氯离子或其他阴离子有通透作用的蛋白通道，在维持细胞的容积平衡、调节细胞内pH值、细胞迁移、细胞增生分化及凋亡过程中发挥重要作用〔3〕。近年关于离子通道参与POAG形成的研究逐渐深入，特别是氯离子通道的作用更受重视〔4〕，本研究将构建的CLC2反义寡核苷酸转染入人眼小梁细胞，观察其对人眼小梁细胞细胞周期的影响，为探讨POAG的基因治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料和主要试剂 永生株人眼小梁细胞(中山大学眼科中心卓业鸿教授惠赠);DMEM/F12培养液、磷酸缓冲液(PBS)和胎牛血清(Gibco公司);pSUPER.puro载体、E.coli JM109和碘化丙啶(PI，OligoEngine公司);LipofectamineTM2000、RTPCR试剂盒和Trizol(Invitrogen公司);DNA marker(TaKaRa公司)，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 人眼小梁细胞体外培养 用含15%胎牛血清的DMEM/ F12培养液培养人眼小梁细胞，置于37℃、5%CO2孵箱内培养。本实验取第3～4代，生长良好、近融合数量恒定的细胞进行实验。
1.2.2 重组表达载体构建与鉴定 在GenBank上查找CLC2基因序列，查阅相关资料、应用siRNA设计软件帮助辅助设计CLC2反义核苷酸序列，根据RNAi的设计原则，设计并合成一对针对CLC2一个RNA干扰靶序列的反义寡核苷酸片段，具体序列为：正义链5′GATCCCCGTTGGAATCCTGTGAGAAGTTCAAGAGACTTCTCACAGGATTCCAACTTTTTGGAA
A3′，反义链5′AGCTTTTCCAAAAAGTTGGAATCCTGTGAGAAGTCTCTTGAACTTCTCAGGATTCCAACGGG3′;其中划线部分是与目的mRNA一致或互补的序列,交由TaKara公司合成。将载体用BglⅡ和HindⅢ在37℃条件下孵育10 h，进行酶切，后用75℃高温10 min灭活两种核酸内切酶，将酶切后的载体片段、退火后的互补寡核苷酸片段、T4 DNA连接酶混匀，16 h孵育过夜使两个片段连接;将其转化入E.coli JM109，挑取单克隆扩增，筛选阳性菌落进行酶切鉴定及序列测定。
1.2.3 转染 将第3代生长状态良好的小梁细胞以4×105个/ml的浓度传代接种于6孔板中，继续置于37℃、5%CO2孵箱内培养直至近融合，用脂质体LipofectamineTM2000将空载体质粒和重组质粒转染小梁细胞(具体步骤按照所购转染试剂盒说明进行)。
1.2.4 RTPCR检测小梁细胞上氯离子通道CLC2 mRNA的表达 根据所购试剂盒指示步骤，提取正常细胞组、空载体组和重组载体组细胞总RNA，将提取的RNA进行鉴定。鉴定正确后以RNA为模板，逆转录方式获得cDNA，反应产物行PCR扩增。引物设计根据Comes N等报道〔5〕。上游引物：5′GCTGTCATTGGTATTGCTAGTGG3′;下游引物：5′AGCGTCTCTTTCTGTGAGAGCTGT3′。25 μl反应体系为：cDNA 2.5 μl、上下游引物各1 μl 、PCRmix 12.5 μl、ddH2O 8 μl，最后在25 μl反应体系中加入15 μl石蜡油。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，拍照后采用Bandscan软件测定分析条带的吸光度值。
1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期 分别取出正常细胞组(A1)、空载体组(A2)和重组载体组(A3)细胞，0.25%胰蛋白酶消化、分散细胞，以PBS洗涤3次后，将每个培养皿中的待检测细胞以0.5 ml PBS重悬，分别加入0.15%Triton X100和5 mg/ml RNase，室温孵育10 min后，加入25 μg/ml PI室温进行DNA染色10 min，350目尼龙膜过滤，流式细胞仪检测细胞周期。
1.3 统计学处理 应用SPSS11.0软件进行数据分析，实验重复3次，数据以x±s表示，组间比较采用t检验。
2 结 果
2.1 重组表达载体的鉴定 按照实验设计提取质粒扩增，双酶切后，重组质粒阳性克隆应得到291 bp片段，阴性克隆应为227 bp。本实验得到的片段如预期片段大小一致，见图1。表明成功获得重组质粒，挑取阳性克隆送检，测序结果表明siRNA序列成功插入表达载体中。
2.2 RTPCR结果 RTPCR半定量结果表明，重组载体组的CLC2表达较空载体组明显降低。以βactin为对照，重组载体组ClC2 mRNA 表达的相对水平与空载体组CLC2 mRNA 表达的相对水平存在显著差异(P<0.01)，见图2。
2.3 流式细胞仪检测细胞周期 正常细胞组与空载体组细胞处于各细胞周期的比例均无显著性差异(P>0.05)，而重组载体组处于G1期的细胞比例明显增加，而处于S期和G2/M期的细胞比例明显降低，与其他两组之间比较均存在显著性差异(P<0.01)，见表1。表1 流式细胞仪检测细胞周期进
3 讨 论
氯离子通道是生物体内一类非常重要的阴离子通道，在生理条件下，通过选择性运输氯离子及其他阴离子而发挥特定的生物学功能〔6〕。CLC2是电压门控氯离子通道的一种亚型，目前已发现多种CLC2相关性疾病〔7，8〕。随着对CLC2认识的不断深入，其结构及功能的研究引起了国内外学者极大的关注。
POAG是临床最常见的致盲眼病之一，虽然目前其发病机制仍不十分清楚，但可以肯定的是：小梁细胞的数量及功能异常是导致房水外流阻力增加的重要因素之一。本课题组前期实验已经证实氯离子通道阻断剂NPPB可以一定程度影响小梁细胞吞噬功能。通过本次研究希望可以了解是否CLC2的异常表达会对小梁细胞的正常细胞周期产生影响。
细胞的生长和增殖是细胞生命活动的体现。细胞增殖能力取决于细胞周期的长短，而细胞周期的长短取决于G1期〔9〕。细胞是否顺利通过G1/S这一关键点，决定了细胞是将进入S期，还是退出细胞周期进入G0期。Shen等〔10〕在研究人宫颈癌细胞时发现，提高氯离子通道阻断剂浓度可以将细胞阻断在G0/G1期，说明氯离子通道的活性在G1/S这个限制点中起关键性作用。Rutledge等〔11〕在研究中发现，ClC2在细胞进入不同的细胞周期中发挥重要作用。
本研究显示，构建的针对CLC2的重组表达载体转染人眼小梁细胞，可以有效地减少细胞CLC2 mRNA的表达;而通过流式细胞仪证实了CLC2 mRNA表达受抑制后，人眼小梁细胞的细胞周期被阻断在G0/G1期，抑制了人眼小梁细胞DNA的合成;同时成功构建了针对人CLC2的siRNA真核表达载体，从基因水平上干扰人眼小梁细胞CLC2的表达，这也为进一步开展针对性的研究CLC2对人眼小梁细胞其他特性影响的实验提供了基础，避免了氯离子通道阻断剂(如NPPB,他莫西芬等)非特异性阻断CLC2的弊端。
综上所述，虽然细胞周期的调控是一个受多因素控制的极为复杂的过程，但CLC2的正常表达对维持人眼小梁细胞正常细胞周期起了至关重要的作用，为治疗POAG提供新的思路。
【参考文献】
1 Tamm ER,Fuchshofer R.What increases outflow resistance in primary openangle glaucoma?〔J〕.Surv Ophthalmol，2007;52(2)：1014.
2 Ferrer E.Trabecular meshwork as a new target for the treatment of glaucoma〔J〕.Drug News Perspect，2006;19(3):1518.
3 Jentsch TJ,Stein V,Weinreich F.Molecular structure and physiological function of chloride channels〔J〕.Physiol Rev，82(2):50368.
4 Nilius B,Droogmans G.Amazing chloride channels：an overview〔J〕.Acta Physiol Scand，2003;177(4)：11947.
5 Comes N,Gasull X,Gual A,et al.Differential expression of the human chloride channel genes in the trabecular meshwork under stress conditions〔J〕.Exper Eye Res,2005;80(2):80113.
6 张晓东，臧益民，周士胜.CLC通道的生物学及相关疾病〔J〕.生理科学进展,2001;32(4)：32730.
7 Sander T,Schulz H,Saar K,et al.Genome search for susceptibility loci of common idiopathic generalized epilepsies〔J〕.Hum Mol Genet,2000;9(10)：146572.
8 Stogmann E,Lichtner P,Baumgartner C,et al.Mutation in the CLCN2 gene are a rare cause of idiopathic generalized epilepsy syndromes〔J〕.Neurogenetics,2006;7(4):2658.
9 杨兆颖,李金梁.细胞周期及其周期调控研究的发展简史〔J〕.中华医史杂志,2004;8(4)：4952.
10 Shen MR,Droogmans G,Eggermont J,et al.Differential expression of volumeregulated anion channels during cell cycle progression of human cervical cancer cells〔J〕.J Physiol,2000;529(6):38594.
11 Rutledge E,Denton J,Strange K.Cell cycle and swelling induced activation of Caenorhabditis elegans CLC channel is mediated by GeGLC7alpha/beta phosphatases〔J〕.J Cell Biol,2002;158(3):43544.
