MMP-2在早产儿视网膜病变新生小鼠模型中的表达

　　作者：姜双，陈晓隆 作者单位：辽宁医学院附属第三医院眼科，辽宁 锦州121000

　　【摘要】 目的 检测MMP-2在新生小鼠模型中的表达，探讨MMP-2在早产儿视网膜病变发病过程中的作用。方法 将7 日龄C57BL/6J小鼠置于75%±2%高氧环境中，5 天后再置于正常空气环境中，建立高氧诱导的早产儿视网膜病变的小鼠模型。于鼠龄17 天时处死动物并摘除眼球，应用免疫组化方法检测视网膜组织中MMP-2的表达情况。结果 MMP-2在对照组和高氧组的积分光密度值分别为16.33±4.13和21.12±6.29，两者比较有显著性差异(t=3.160，P<0.01)。结论 MMP-2可能对早产儿视网膜病变的新生血管生成有一定作用。

　　【关键词】 早产儿视网膜病变;MMP-2;视网膜新生血管

　　Expression of MMP-2 in a Rat Model of Retinopathy Pathology of Premature BabiesJIANG Shuang, CHEN Xiaolong(Department of Ophthalmology, the Third Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121000 China)Abstract:Objective This research using Oxygen Induced Retinopathy model examines the expressions of MMP-2 and inquires its contribution into retinopathy pathology of premature babies. Methods 7-day newborn C57BL/6J rats were raised in standardized incubator and exposed to (75±2)% oxygen concentration for 5 days, then returned to normal air, in order to establish a rat model of retinopathy pathology of premature babies. Rats were killed on the 17th day of life. Retinas were dissected and stained by immunohistochemical method. Results IOD of MMP-2 was significantly increased 21.12±6.29 in the ROP group, and 16.33±4.13 in the control group. There was significant difference (t=3.160，P<0.01) in the level of MMP-2 between ROP group and control group. Conclusions It suggests that the existence of MMP-2 in a rat model do exert some effect on the generation of retinal neovascularization of premature babies retinopathy pathology.

　　Key words:retinopathy pathology of premature babies; MMP-2; retinal neovascularization

　　早产儿视网膜病变(Retinopathy of prematurity，ROP)是发生于早产和低体重儿的一种致盲性视网膜病变，其病理特征为视网膜血管异常增生，严重者可引起玻璃体出血、视网膜变性、视网膜脱离等多种并发症。上世纪80年代以来，由于医疗技术的快速发展，早产儿的成活率也显著提高，ROP的发病率也随之呈上升趋势，在体重低于1 000 g的超低体重儿，发病率高达80%以上[1,2]。目前，ROP已经成为世界范围内儿童致盲的重要原因，约占儿童致盲原因的6%～18%[3]。防治ROP以改善早产儿的生存质量己成为全球关注的焦点。己经明确ROP与吸氧治疗高度相关，早产、高氧和低出生体重是发病过程中最为关键的因素，但其发病的确切机制至今仍不明确。

　　研究表明，视网膜新生血管形成在ROP的发病机制中起主导作用。尽管近年来人们对视网膜新生血管的认识研究有了不少突破，但由于其确切发病机制仍然不明，目前临床上尚无完全根治性手段。在对视网膜新生血管发生机制的研究中，诸多生长因子、细胞因子和炎症介质发挥的作用一直是关注的重点。近些年来，对基质金属蛋白酶的研究成为热点。

　　本研究在早产儿视网膜病变的小鼠模型中，应用免疫组化方法，检测了基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达，进一步探讨MMP-2在早产儿视网膜病变发病过程中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物

　　中国医科大学附属盛京医院动物实验中心提供的健康的清洁级C57BL/6J幼鼠(与哺乳母鼠在一起)，选择鼠龄7 天的共40 只，雌雄兼有。

　　1.2 实验试剂

　　MMP-2免疫组化试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。

　　1.3 早产儿视网膜病变小鼠模型的建立

　　选择鼠龄7天的健康清洁级C57BL/6J幼鼠40 只，与哺乳母鼠在一起，雌雄兼有，随机分成2组，高氧组20 只，对照组20 只。对照组在正常环境温度下饲养;高氧组置于密闭有机玻璃容器内。容器内接入100%湿润医用纯氧气，使容器内氧分压保持在75 %±2 %，并用测氧仪全程监测容器内的氧分压，确保氧浓度的恒定。高氧环境下饲养5天，然后移置正常环境温度中饲养。每天日光照明12小时，环境温度控制在(23±2)℃。每日打开氧箱更换垫料、加食、替换母鼠1次。

　　1.4 标本的制备

　　鼠龄17 天时处死幼鼠，将眼球摘除，浸泡于4 %多聚甲醛中性缓冲液中固定24 小时，保存温度为4 ℃。梯度酒精脱水、二甲苯透明，常规石蜡包埋。标记方向，制作切片时应避开视乳头周围，含有视神经的切片应排除在外。连续切片，厚度6 μm，切片方向平行于角膜至视乳头的矢状位平面。

　　1.5 免疫组化法

　　按照即用型SABC免疫组化试剂盒使用说明书进行操作：石蜡切片置于60 ℃烘箱2～3小时溶解石蜡，二甲苯常规脱蜡至水，0.3%过氧化氢室温孵育5～10 分钟，切片置于抗原修复液中92～98 ℃水浴10 min，室温中冷却20 min。滴加5%BSA封闭液，滴加适当稀释的一抗(1：150)，4 ℃过夜。次日滴加生物素标记的二抗工作液，置湿盒内37 ℃，滴加试剂SABC，室温孵育30 min。DAB显色：使用DAB显色剂试剂盒，取蒸馏水1 mL，加试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后加至切片，室温避光10 min。苏木素复染1 min，脱水、透明、封片、镜下观察。

　　1.6 统计学分析

　　实验数据采用均数±标准差表示，所有数据均以统计分析软件SPSS 11.5 for windows 进行分析，采用独立样本t检验方法，以P<0.05作为差异有统计学意义的标准。

　　2 结 果

　　2.1 MMP-2在视网膜的表达

　　MMP-2以背景清晰细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，主要位于视网膜内界膜附近，神经节细胞层，内核层。

　　2.2 免疫组化的半定量检测

　　每张切片在高倍显微镜下随机选择10个视野，采用Metamorph/DP10/BXS 1图像分析软件，测量其积分光密度值(IOD值)，MMP-2在对照组和高氧组的积分光密度值(IOD值)分别为16.33±4.13和21.12±6.29，两者比较有显著性差异(t=3.160，P<0.01)。

　　3 讨 论

　　研究认为早产儿视网膜病变的主要病理改变为视网膜新生血管生成，而视网膜新生血管的发生过程是从预先存在的血管形成新的毛细血管，因此在其最初阶段必须使血管内皮细胞趋化、迁移通过基底膜，而这一过程必须通过基质金属蛋白酶消化血管内皮细胞层下面的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)屏障[4]。

　　基质金属蛋白酶是一类活性依赖锌离子和钙离子的可以降解细胞外基质的蛋白水解酶，包括约20 种酶，主要分为胶原酶类(MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18 ) ，明胶酶类(MMP-2、MMP-9)，基质水解酶类(MMP-3、 MMP-10、MMP-11)，膜型酶类(MT -MMP)等，它们的分子量从20～100 kDa不等，作用的底物有一定的重叠性，其中明胶酶的作用主要是清除变性的胶原和Ⅳ型胶原。而Ⅳ型胶原是组成血管基底膜和细胞外基质的主要结构蛋白，因而明胶酶MMP-2作为主要降解Ⅳ型胶原的基质金属蛋白酶在新生血管形成过程中起着重要作用[5]。研究表明，MMP-2与新生血管形成密切相关[6]。MMP-2通过降解变性的胶原和基底膜Ⅳ型胶原，有利于血管内皮细胞的迁移，并为毛细血管网络增生提供了空间，而基底膜和间质胶原的降解产物对内皮细胞也有趋化作用，有利于血管内皮细胞的定向迁移，从而引起新生血管的形成。

　　一些研究团体已经检测了在视网膜新生血管中MMPs的表达形式和可能的作用。Das等[7]报道糖尿病人视网膜外层新生血管膜含有高水平的细胞外蛋白水解酶，其中包含MMP-2、MMP-9和尿激酶。Majka等[8]报道在小鼠增殖性视网膜病变模型中MMP-2、MMP-9和I型MMP的表达增加。Das等[9]报道氧诱导的视网膜病变模型中，腹膜内注射MMPs抑制剂可显著抑制视网膜新生血管的生成。我们通过建立高氧诱导的视网膜新生血管小鼠模型，发现高氧组MMP-2的表达明显高于对照组，提示MMP-2与视网膜新生血管生成之间存在关联。Kyoko Ohno-Matsui，Tomoko Uetama等[10]建立了氧诱导的视网膜病变小鼠模型，发现MMP-2缺乏型(MMP-2-/-)的小鼠视网膜外新生血管形成明显少于野生型小鼠(MMP-2+/+)，这也可以证实我们的结论。因此认为MMP-2可能是视网膜新生血管形成的调节中所必须的。也有研究认为[11]， MMP-2无论对小鼠视网膜血管生成还是病理性视网膜新生血管生成都不是必不可少的。用MMP-2抑制剂进行干预将成为治疗早产儿视网膜病及其他新生血管性视网膜病的新途径。

　　【参考文献】

　　[1] Palmer EA，Flynn JT，Hardy RT,et al. Incidence and early course of retinopathy of prematurity[J]. Ophthalmoloty，1991，98(11):1628-1640.

　　[2] Joao Borges Fortes Filho，Cristiano Koch Barros. Retinopathy of prematurity in a tertiary center in south of Brazil[J]. International Journal of Ophthalmology，2007，7(1):31-35.

　　[3] Gilbert C，Rahi Jeckstein M,Eckstein M，et al. Retinopathy of prematurity in middle-income countries[J]. Lancet，1997，350(9070):12-14.

　　[4] Smith LE. Pathogenesis of retinopathy of prematurity[J]. Semin Neonatol，2003，8:469-473.

　　[5] Sang QA，Douglas DA.Computationa Sequence Analysisof Matrix Metalloproteinases. [J]. Protein Chem,1996，15: 137-160.

　　[6] Forsyth PA，Wong H,Laing TD,et al. Gelatinase-A(MMP-2),gelstinase-B(MMP-9) and membrane typematrix metalloproteinase-1(MTl-MMP) are involved in different aspects of the pathophysiology of malignant gliomas[J]. Br J Cancer，1999，79(11-12): 1828-1835.

　　[7] Das A，McGuire P，Eriquat C，et al. Human diabetic neovascular membranes contain high levels of urokinase and metalloproteinase enzymes[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，1999，40: 809–813.

　　[8] Majka S，McGuire P，Colombo S，et al.The balance between proteinases and inhibitors in a murine model of proliferative retinopathy[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2001，42: 210-215.

　　[9] Das A，McLamore A，Song W，McGuire PG. Retinal neovascularization is suppressed with a matrix metalloproteinase inhibitor[J]. Arch Ophthalmol，1999，117: 498-503.

　　[10] Kyoko Ohno-Matsui,Tomoko Uetama. Reduced Retinal Angiogenesis in MMP-2 Deficient Mice[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44(12): 5370-5375.

　　[11] Sylvia Sarman ，Ingeborg van der Ploeg. Retinal Vascular Development and Pathologic Retinal Angiogenesis Are Not Impaired in Matrix Metalloproteinase-2 Deficient Mice[J]. Current Eye Research，2005，30(4): 259-267.