结膜细胞外基质与羊膜在结膜重建中的实验研究

　　作者：辛向阳 高莉莉 作者单位：(内蒙古医学院第三附属医院眼科，内蒙古包头 014010)

　　【摘要】 目的：观察结膜细胞外基质(extracellular matrix，ECM)与羊膜作为结膜组织的替代材料用于结膜成形的特点及效果。方法：饲养30只新西兰白兔，将其中6只白兔的球结膜制成结膜ECM,并将剩余的白兔随机分为实验组和对照组，每组12只;实验组兔结膜采用组织工程技术制备的结膜ECM行结膜移植修补术，对照组采用低温冷冻保存的羊膜移植，以观察移植修补术后结膜成形的情况，并行肉眼、镜下、免疫组化及淋巴细胞毒检查。结果：实验组结膜ECM移植后1周可见新生血管自移植边缘长入，8周时外观已接近正常结膜，无免疫排斥反应，光镜下可见移植后4周的移植区上皮已接近正常结膜上皮;对照组术后4周移植区仍有部分上皮未覆盖。结论：结膜ECM为目前比较理想的结膜替代材料，并可有效地用于角膜、结膜表面重建。

　　【关键词】 细胞外基质;结膜;羊膜;移植

　　An Experimental Study on Conjunctival ECM Transplantation

　　XIN Xiangyang, GAO Lili.

　　(Department of Ophthalmology, The Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia

　　Medical College, Baotou 014010, China)

　　Abstract Objective: To investigate the characteristics and the effect of conjunctival extracellular matrix (ECM) and Amniotic membrane as a succedaneum for conjunctiva. Methods: 30 New Zealand rabbits were raised for the experiment. The conjunctival defect models were made of bulber conjunctiva from six rabbits and then all others were randomly divided into the test group(12 Rabbits) and the control group(12 rabbits). The conjunctival defect in the test group was repaired with conjunctival ECM and that in the control group was repaired with transplantation of the refrigerated amniotic membrane. All of them were photographed and examined by light microscope , immunohistochemical examination and lymphocyte toxicity test. Results: There were blood vessels growing into the grafts one week after conjunctival ECM transplantation in the test group and the grafts became mildly congestive and similar to normal conjunctival ones in the 8th week,without any immunologic rejection. Epithelium in the grafts could be seen through the light microscope to grow close to the normal one 4 weeks after transplation. But in the control group, the grafts were not completely covered with epithelium 4 weeks after transplantation. Onclusion: Conjunctival ECM has the characteristics of tissue activity and low antigenicity. It is an ideal conjunctival succedaneum for conjunctiva in conjunctiva transplantation and could be used as a graft to reconstruct ocular surface as well.

　　Key words Extracellular matrix; Conjunctiva; Amniotic membrane; Transplantation

　　结膜损伤是临床上较为常见的眼科疾病，表现为结膜瘢痕形成、睑球粘连、眼球运动障碍、干眼，严重者可出现假性胬肉及角膜混浊、进行性角膜结膜化或血管化，导致视力下降，不仅影响美观，而且也常是致盲的主要原因，严重影响患者的生活质量。因此，长期以来，眼科医师一直研究结膜损伤的治疗方法，对于创面较大的结膜损伤，保守治疗是无效的，只能通过手术修复来解决。而结膜损伤修复重建手术的关键是结膜替代物。因而人们一直致力于结膜替代物的研究，如最早的自体结膜、异体结膜、口腔黏膜及鼻黏膜等黏膜组织，Polytef异物移植膜等。

　　近年来，在眼表研究方向取得重大突破，使羊膜移植在结膜损伤的修复重建中应用比较广泛。随着组织工程技术的兴起，人们对细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)进行了广泛的研究。我们将结膜ECM、羊膜进行结膜缺损修复比较，为进一步证实结膜ECM作为一种有前景的结膜替代物提供有力的证据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 选用新西兰白兔30只，雌雄不限，体重3±0.2 kg，无任何眼表疾病，选用豚鼠(荷兰猪)12只，体重300±20 g。

　　1.2 脱细胞结膜ECM来源 取6只饲养的新西兰白兔结膜送至北京大学清源伟业生物制品公司进行脱细胞处理，制成结膜ECM。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 动物分组 将24只健康、体重为3kg的大白兔随机分成2组，即实验组12只，采用结膜ECM行移植修补术;对照组12只，采用低温冷冻的羊膜移植。

　　1.3.2 动物模型的制备 给兔肌注苯巴比妥8 mg/kg和氯丙嗪12.5 mg/kg作麻醉，冲洗右眼结膜囊，右眼滴0.5 %丁卡因表麻液，开睑器开睑，无菌条件下，切除24只兔右眼上方的结膜，距离上方角膜缘2.5 mm，切除结膜的面积大小约20 mm×8 mm。将切除的结膜浸泡于含庆大霉素的生理盐水(庆大霉素8万u+0.9 %生理盐水100 mL)备用。实验组用10-0尼龙缝线缝合结膜ECM，对照组缝合低温冷冻的羊膜，次日换药，术眼点抗生素眼药水，每日3次，连用2周。2周后将术眼缝线全部拆除。

　　1.3.3 肉眼观察及拍照 实验组及对照组均分别于术后每日观察移植片的生长情况，每周拍照外眼图像。

　　1.3.4 HE染色光镜下观察 实验组及对照组各12只动物分别在术后1、2、4、8周时各取下2只动物的术眼移植区组织，用生理盐水冲洗后，置于10 %中性甲醛液中固定24 h，常规脱水，包埋，切片，HE染色后，组织学观察。

　　1.3.5 免疫组化检查 取实验组术前的结膜、脱细胞结膜ECM以及实验组术后4、8周移植区组织，行免疫组化染色。

　　1.3.6 淋巴细胞毒检查 取实验组和对照组术前及两组术后1、2、3周兔的静脉血2 mL，分离血清，抽取供体兔肝素抗凝血3 mL，放置0.5 h，用淋巴细胞分离液提取供体淋巴细胞。取供体淋巴细胞20 μL，受体兔血清20 μL，豚鼠血清补体40 μL，放置1 h。1 %台盼兰20 μL染色，放置0.5 h，在光镜下观察并计算存活淋巴细胞数。

　　1.4 统计学方法 本研究使用SPSS11.5统计软件。采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 术后移植区组织肉眼观察及HE光镜下检查结果 实验组术后1周大体观察，移植片边缘可见新生血管长入;光镜下移植区可见单层上皮细胞覆盖ECM，并可见新生血管及少量淋巴细胞，基质中可见胶原纤维及弹性纤维。术后2周大体观察，移植片边缘可见大部分新生血管长入;光镜下移植区可见3～4层上皮细胞覆盖ECM，胞浆丰富，并可见新生血管及淋巴细胞，基质中可见成纤维细胞及弹性纤维。术后4周大体观察，结膜充血明显减轻，血管纹理清晰，移植片表面光滑，无瘢痕;光镜下移植区可见复层鳞状上皮完全覆盖，胞浆少，并可见新生血管及少量淋巴细胞，基质中可见成纤维细胞及弹性纤维。术后8周大体观察，移植区外观与正常结膜基本一致;光镜下移植区结构与正常结膜基本一致，可见2～3层上皮细胞、杯状细胞、血管及胶原纤维。见图1。

　　对照组术后1周大体观察，移植片仅见少量新生血管长入;光镜下移植区部分上皮细胞长入，炎性细胞较多。术后2周大体观察，移植片仅见大部分新生血管长入;光镜下可见大部分上皮细胞长入，炎性细胞减轻。术后4周大体观察，移植片颜色变为粉红色;光镜下移植区可见多层上皮细胞、淋巴细胞、弹力纤维及血管。术后8周大体观察，结膜大部分覆盖移植区，轻度充血;光镜下移植区可见多层上皮细胞、淋巴细胞、少量的杯状细胞、弹力纤维及血管。见图2。

　　2.2 免疫组化检查结果 实验组移植术后4周，镜下可见上皮细胞完全覆盖ECM，未着色，基质中Ⅰ型胶原染色阳性;实验组移植术后8周，镜下可见移植区与正常结膜一致，上皮细胞未见着色，基质中Ⅰ型胶原染色阳性。

　　2.3 淋巴细胞毒检查结果 实验组术后1、2、3周时的淋巴细胞存活数与术前比较差异无统计学意义(t=0.586、-0.208、1.206，P>0.05);对照组术后1、2、3周淋巴细胞存活数与术前比较减少，差异有统计学意义(t=6.178、10.986，P<0.01)。

　　3 讨论

　　3.1 实验设计 穹隆结膜位于睑结膜和球结膜之间，为结膜最松弛的部分。此位置组织相对最厚，而且内含丰富的弹力纤维，伸缩性大[1]。另外，穹隆部结膜也存在结膜干细胞，故此处结膜缺损，通过自身是很难修复的，别的组织又无法代替，故用同种同位置的结膜ECM进行移植修复。同时由于考虑角膜缘干细胞的存在，故本实验取材部位选在上方角膜缘2.5 mm处。若将角膜缘的上皮完全切除，则可导致角膜持续性上皮缺损、复发性上皮糜烂、新生血管生长及假性胬肉的侵入，严重者发生角膜溶解、溃疡乃至角膜穿孔[2]。由于考虑到上述因素，本实验从开始到结束，对所有3组动物的角膜无任何影响。结膜缺损的面积若小于5 mm2则通过自身的修复或保守治疗，完全可以愈合。故本实验切取结膜面积的大小为20 mm×8 mm进行移植修补术。结膜损伤的类型较多，因而影响组织修复的因素也较多，本研究采用单纯机械性损伤造成结膜缺损，减少了影响组织修复的因素。

　　3.2 结膜ECM的低抗原性 同种异基因移植的排斥反应，是由受者的T细胞介导的，针对移植抗原的免疫应答，这一免疫应答是通过受者T细胞表面的T细胞受体(TCR)识别移植物细胞表面的同种异型抗原引发的[3]。利用组织工程技术将结膜进行脱细胞处理，脱去含有移植抗原的细胞，制成结膜ECM。ECM是一种细胞外的大分子超复合结构，主要由胶原蛋白、蛋白多糖及糖蛋白3种成分组成，无细胞成分[4]。这样结膜ECM移植后，就可以避免排斥反应的发生，而且它已被证实无明显免疫原性[5]。本实验中，实验组术后1周即有新生血管从周围向移植片边缘长入，术后2周镜下观察可见移植片有较多炎性细胞，术后4周移植区有少量炎性细胞存在，并可见较多具有分泌功能的杯状细胞。正是由于ECM的低抗原性，本实验中实验组12只兔的移植片全部成活，8周移植片外观与正常结膜一致，镜下观察可见结膜上皮已完全覆盖移植区。羊膜具有抗原性低、促进眼表上皮化、减轻炎症反应、抑制新生血管形成和纤维组织增生等特殊作用[6]。在本实验中，对照组术后2周移植片边缘可见新生血管长入，术后4周镜下观察移植区可见部分上皮覆盖，有少量炎性细胞浸润。补体依赖性微量淋巴细胞毒实验是经典的检测体液免疫的实验。根据淋巴细胞毒实验[3]结果,经统计分析，实验组术前与术后比较差异无统计学意义，即试验组各时间段无明显的体液免疫排斥反应[7]，这说明移植后动物机体内未发生免疫应答，所以实验组的12只兔的结摸ECM移植全部成功。而对照组术后1、2、3周与术前正常组比较差异有统计学意义，即对照组各时间段的体液免疫排斥反应明显，这说明羊膜移植后动物机体内发生了免疫应答。

　　3.3 结膜ECM与组织损伤修复的关系 创伤愈合是一个复杂而又高度协调的过程[8]，基本上可以分为局部炎症反应、细胞增殖分化和组织修复重建3个既有区别又相互交错的阶段，这一过程涉及各种生长因子和细胞因子的相互作用、相互影响、共同调控细胞迁移、增生、分化、血管生成、基质沉积和组织塑形等。创伤修复依赖于细胞与ECM的相互作用[9]。

　　ECM在任何组织都占有相当的比例，它的主要作用是把细胞连接在一起，借以支撑和维持组织的生理结构和功能[10]。本实验中实验组术后1周即有新生血管从周围向移植片边缘长入，2周移植片已成为粉红色半透明状。术后4周移植片表面光滑，无瘢痕。术后8周移植区外观已与正常结膜一致。光镜观察实验组术后1周即有部分上皮长入，术后2周3～4层鳞状上皮覆盖于大部分ECM上，术后4周多层鳞状上皮完全覆盖移植区，结构接近正常结膜上皮，术后8周移植区全部被新生结膜组织覆盖。对照组术后2周才有部分结膜上皮覆盖移植区。由此可见结膜ECM移植后可使结膜再生速度加快，这与它的结构和生理功能是密切联系的。组成ECM的胶原蛋白(Collagen)对细胞的生长、分化、细胞粘附及迁移都有明显的影响;蛋白多糖(Proteoglycans)是构成ECM的主要成分，它能把多种细胞粘合在一起形成组织或器官，并参与体内的凝胶和溶胶体系，对物质交换、渗透压平衡等起重要作用，因而影响细胞的新陈代谢、生长与分化;粘连蛋白(adhesive glycoproteins)对细胞的粘附、移行和增殖均有影响[11]。

　　3.4 结膜ECM的转归 本实验中通过对术前正常兔结膜组织、脱细胞结膜组织及术后实验组移植区组织进行免疫组化检查，发现其共同的胶原类型都是Ⅰ型胶原。这一结果证明结膜经过脱细胞处理后其基本的胶原结构存在。脱细胞结膜作为一种生物支架，保留了胶原纤维和小血管中的基质成分，这些物质都有助于引导受体细胞和新生血管的长入，形成新的ECM，从而取代脱细胞结膜，最终形成新的结膜组织[12]，这一点有待更深入的研究证实。另外组织损伤修复过程中，ECM经过代谢调整，其成分也会有所改变，如Ⅲ型胶原减少而Ⅰ型胶原增多，使修复组织能力增强[13]。本实验未检测Ⅰ型及Ⅲ型胶原的含量，以后将做进一步研究。

　　4 小结与展望

　　本实验研究证实：(1)结膜ECM具有低抗原性;(2)结膜ECM可诱导细胞生长,使结膜再生速度加快;(3)结膜ECM是一种有前景的结膜替代物。随着细胞生物学、分子生物学及生物工程材料科学的发展及研究深入，组织工程学材料之一——ECM作为修复缺损区的材料得到了广泛应用。结膜ECM作为一种结膜替代材料已在动物进行了同种、同位置、异基因的移植并取得成功，能否在人体进行同种异体移植以及动物与人之间的异种异基因的移植，尚需进一步的实验研究与临床观察。

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