维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡及细胞内钙变化

　　作者：庞东渤，洪晶

　　【摘要】 目的：探讨钙通道拮抗剂—维拉帕米(verapamil，Ver)对体外培养的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞凋亡诱导作用及凋亡过程中细胞内钙浓度[Ca2+]i的变化。方法：应用80mg/L的Ver作用体外培养hRPE细胞12，24及48h，采用吖叮橙(AO)荧光染色法、透射电镜、流式细胞术观察hRPE细胞凋亡;Fluo-3/AM负载技术，观察凋亡过程中细胞[Ca2+]i的变化。结果：一定浓度Ver可诱导hRPE细胞凋亡，荧光显微镜及电镜观察hRPE细胞具有早期凋亡特征：核荧光呈黄绿色，电镜下核染色质浓染、边集。流式细胞术显示，Ver作用后的hRPE细胞凋亡百分率增加(F =12.3415，P <0.05)。Ver作用的hRPE细胞内钙浓度([Ca2+]i)呈下降趋势(F =23.607， P <0.01)。 结论：Ver能诱导体外培养的hRPE细胞凋亡，细胞内[Ca2+]i浓度的变化可能是诱导hRPE凋亡的机制之一。

　　【关键词】 视网膜色素上皮细胞

　　0引言

　　增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreo retinopathy，PVR)是孔源性视网膜脱离的常见并发症和手术失败的主要原因，尽管玻璃体视网膜手术技术不断提高，但复发率并未改善[1] ，同时玻璃体切割手术本身就是诱导PVR形成的一个危险因素[2]。RPE细胞的迁移、增殖可启动PVR的形成，而细胞内Ca2+的升高是RPE细胞增殖的危险因素[3]。Ver是一种可靠的慢钙通道阻滞剂，能阻止细胞外钙内流，在PVR发生中对RPE细胞增殖起着重要调节作用[4]。本研究应用一定浓度钙通道阻断剂Ver，作用于体外培养hRPE细胞，诱导其凋亡并观察凋亡过程中细胞内[Ca2+]i的变化。

　　1材料和方法

　　1.1材料 流式细胞仪(B.D公司)，DIAGNOSTIC INSTRUMENTS-SPOT INSIGH荧光摄像(USA)系统及MetaFluo4.5/coolsnapfx/IX70细胞内钙离子荧光成像(USA)测定系统。DMEM培养基(Gibco)、新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、胰蛋白酶(1∶250 Difco，Gibco)、维拉帕米(verapamil，Ver)、二甲基亚砜(DMSO)、吖叮橙(AO)、A23187均为美国Sigma公司产品;Fluo-3/AM荧光探针(Eugene Oregon, USA);其它试剂均为国产分析纯。采用胰蛋白酶消化法[5]。在无菌状态下，取角膜移植后的供体眼球(供体年龄限制24～38岁)，在无菌PBS液中沿角巩膜缘后2mm处环形剪开，弃去眼前节及玻璃体，自视盘处分离视网膜神经上皮层，加入2.5g/L胰酶消化混合液，于37℃消化1h，加入含200mL/L新生牛血清DMEM的培养液，用吸管吹打RPE细胞面使细胞脱落，将含RPE细胞的液体移入离心管中，离心1 000r/min×8min，弃上清后，加入培养液，调整细胞密度1×105/L，将RPE细胞悬液接种于6孔板内，37℃，50mL/L CO2孵箱中培养。RPE传代培养同文献[6]，3～6代细胞用于本实验。

　　1.2方法 将第3代的hRPE细胞种植于内置盖玻片的24孔板中，加入Ver 80mg/L，作用12，24，48h后，取出玻片，与未加药的对照组，投入950mL/L乙醇中固定30min，微干，10mL/L醋酸作用30s，1×10-4吖啶橙(AO)染色1min，0.1mol/L氯化钙处理2min。PBS漂洗3次。且用PBS封片，荧光显微镜下直接观察，每孔重复3次。在4℃条件下离心，收集80mg/L Ver作用12，24，48h后及未加药的hRPE细胞5×106个/L，加入等量25g/L戊二醛固定，离心5min，弃去上清，移至离心管中，加入25g/L戊二醛固定，4℃作用30min。常规电镜固定包埋，柠檬酸铅染色，透射电镜上观察，摄片。以80mg/L浓度的Ver，作用12，24，48h后，收集2×106/L个细胞，离心1 000r/min×5min，PBS漂洗1次。离心去PBS，加入PI染液0.5mL，4℃避光作用30min。荧光染色剂PI用氩离子激发荧光，激光发光波长488nm，流式细胞仪采集数据，cellquest分析软件分析，通过计算凋亡区(亚二倍体区)细胞数量得出凋亡率。每个样本重复3次。将1×105/L细胞接种于3.5cm2的一次性培养皿中，待细胞80%融合后，加入终浓度80mg/L的Ver，作用12，24，48h，换液后，加入无血清DMEM液体1mL，加入终浓度10μmol/L FLUO-3/AM染色，37℃，50mL/L CO2孵箱内孵育45min，PBS充分洗去染料，室温静置15min后，置于MetaFluo4.5/coolsnapfx/IX70细胞内钙离子荧光成像测定系统操作台上，25℃测定单个细胞钙荧光强度，激发波长488nm，40倍物镜观察，每组计算20个单个细胞钙离子浓度，取其均值。加入A23187 5μmol测定最高荧光强度值， 加入0.2mmolMnCl2测定最低荧光强度值，细胞内钙浓度按[Ca2+]i=Kd(Fmax-F)/(F-Fmin)公式计算，Kd=400，Fmax为最强荧光值，Fmin为最低荧光值，F为测得细胞荧光值。

　　统计学处理：采用方差分析进行统计学检验，统计过程均用SPSS10.0软件进行，数据用x±s表示。

　　2结果

　　2.1 AO染色结果 在荧光显微镜下，未加药组AO染色的HRPE细胞呈梭形，细胞质呈红色荧光，细胞核呈绿色均匀荧光，可见深染细胞核核仁(图1)。 经80mg/L Ver作用后，可见凋亡细胞呈圆形，体积明显缩小，细胞核内可见致密浓染的黄色荧光(图2)。Ver作用48h后的凋亡细胞数量比24h的明显增多，贴壁细胞明显减少。而作用12h的细胞与未加药组细胞比较无明显变化。

　　图1 正常hRPE细胞呈梭形，细胞质呈红色荧光，细胞核呈绿色均匀荧光，可见深染细胞核核仁 AO×200

　　图2 Ver作用hRPE细胞48h，细胞呈圆形，体积明显缩小，细胞核内可见致密浓染的黄色荧光 AO×200

　　2.2透射电镜结果 正常hRPE细胞超微结构见细胞核膜完整，染色质均匀分布。Ver作用12h后，细胞超微结构与未加药组无明显差异。作用24h时凋亡的细胞在电镜下可见：细胞核内出现染色质边集及染色体固缩，电子密度增强，细胞体积变小，细胞浆浓缩，其内细胞器保存较好，细胞浆内可见空泡增多，细胞膜保存完整，可见细胞膜芽生出泡现象。48h时可见核染色质浓缩和细胞膜芽生出泡(图3)。

　　图3 Ver作用48h的HRPE细胞，电子密度增强，核膜凹陷，染色质浓缩，边集TEM×6 700

　　2.3流式细胞仪检测结果 Ver作用12h时，G0/G1期前可亚二倍体峰，24，48h亚二倍体峰逐渐增高。根据流式细胞仪显示G0/G1期前的亚二倍体区所占百分率计算凋亡率，Ver作用12，24，48h的凋亡率(%)分别为8.21±1.20，16.14±4.60，23.93±3.63，组间比较，差异有显著性意义(F=12.3415， P<0.05),随着时间的延长，凋亡率逐渐增加。

　　2.4 hRPE细胞[Ca2+]i变化 荧光图像显示，正常HRPE细胞显示Ca2+荧光分布，胞核荧光最强，胞质次之(图4，5)。Ver可降低hRPE细胞内[Ca2+]i,正常hRPE细胞及Ver作用hRPE细胞12，24，48h时细胞内[Ca2+]i(nmol/L)分别为197.25±29.03、176.09±25.88，156.45±20.60，135.28±21.18，组间比较，具有显著性差异(F=23.607，P<0.01)。

　　图4正常HRPE细胞钙荧光，见细胞内钙荧光，胞核荧光强，胞核次之Fluo-3/AM×400

　　图5A-C 分别为Ver作用12，24，48h时hRPE细胞钙荧光像，可见钙荧光强度逐渐减弱Fluo-3/AM×400

　　3讨论

　　研究认为，PVR是眼组织对创伤修复反应的一种过度增殖的结果，其基本病理过程是原发性视网膜脱离或眼球穿通伤后的炎症反应，宿主细胞的游走、增生、膜形成，增生膜与视网膜粘连和收缩，形成对视网膜的牵拉，引起牵拉性视网膜脱离。细胞迁移、增殖、收缩是形成PVR的关键病理过程，抑制这些病理过程的发展可防止PVR的形成。Ca2+作为细胞的第二信使及细胞增殖的启动因子，其浓度的变化对细胞生长及有丝分裂具有调控作用，同时第二信使Ca2+的变化是PVR发病机制之一[7]。国外研究发现降低细胞内Ca2+浓度可抑制RPE细胞增殖[8]，我们的前期工作已证明hRPE细胞冷冻后细胞内Ca2+浓度明显增高，因此推测细胞内游离Ca2+浓度的增高可能是hRPE细胞迁移和增殖的机制之一[9,10]。我们应用80mg/L Ver作用体外培养的hRPE细胞，AO荧光染色、透射电镜和流式细胞术检测，可见典型的凋亡改变，而且随着作用时间延长，细胞凋亡百分比逐渐增高，表明一定浓度Ver可诱导hRPE细胞凋亡。

　　同时为研究hRPE细胞凋亡与细胞内[Ca2+]i关系，应用Fluo-3/AM荧光探针测定凋亡过程中hRPE细胞内[Ca2+]i的变化。Fluo-3/AM是新一代钙离子荧光染料，它在可见光谱激发，激发波长488nm，因而减少了需紫外光作激发时对活细胞的光损伤，其与Ca2+结合式的荧光强度较游离形式高40～100倍。因而避免了自发荧光的干扰。Fluo-3与Ca2+亲和力低，容易解离，适合测定细胞内Ca2+的快速、微量变化。Rosenthal等[11]在培养不同物种的RPE细胞时发现，RPE细胞膜上存在电压依赖Ca2+通道，而且这种离子通道为典型的L型通道，Himpens等[12]在培养hRPE细胞时探讨Ca2+信号转导机制，认为RPE细胞内及细胞膜之间均有Ca2+流的改变，hRPE细胞这种典型的L型通道对Ver敏感。结合本研究结果，Ver阻断了hRPE细胞的L型通道，降低细胞内[Ca2+]i，引起细胞内钙平衡破坏，进而诱导hRPE细胞凋亡。[Ca2+]i的变化可能是hRPE凋亡的关键信号，同时凋亡的产生也可能涉及其他信号系统，尚待进一步实验来证明。

　　Ver是一种可靠的慢钙通道阻滞剂，降低细胞内[Ca2+]i，而且抑制体外培养hRPE细胞增殖[13]。本研究选用Ver作用体外培养的hRPE细胞，发现Ver能诱导hRPE细胞凋亡，同时发现细胞内[Ca2+]i的变化可能是hRPE细胞凋亡的关键信号。如能将此药物应用扩展到诱导凋亡，且作用于眼内RPE细胞，具有较好的发展前途。

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