奥曲肽体外对黑色素瘤细胞株A375分泌VEGF的影响

　　作者：刘桂琴，应方微 作者单位：518040)中国广东省深圳市，暨南大学第二临床医学院深圳市眼科医院

　　【摘要】 目的：了解奥曲肽对体外培养黑色素瘤细胞株A375的影响。方法：体外培养扩增A375细胞，分别与浓度为5，1，0.2，0mg/L的奥曲肽共培养24，48，72h，利用MTT法测定各组奥曲酞对A375细胞增殖作用的影响，通过ELISA法测定奥曲酞对A375细胞分泌VEGF作用的影响。结果：共培养24h后，奥曲酞对A375细胞增殖有显著促进作用(F=14.180，P=0.00)， 48h及72h增殖作用不明显;奥曲酞浓度及作用时间对体外培养的A375细胞分泌的VEGF含量有显著性影响(浓度因素：F=24.441，P=0.00;时间因素：F=127.233，P=0.00)，各浓度的奥曲酞与A375细胞共培养后24h均呈现明显的增加细胞分泌VEGF的作用，浓度越高增加的越少(单向方差分析F=19.489，P=0.00);随着作用时间的延长，细胞分泌VEGF减少， 72h各浓度的奥曲酞均明显抑制A375细胞分泌VEGF，浓度越高抑制作用越明显(单向方差分析F=16.116，P=0.002)。结论：奥曲肽对黑色素瘤细胞A375分泌VEGF长期的趋势上是抑制作用，与时间和剂量呈依赖关系。

　　【关键词】 生长抑素;黑色素瘤;血管内皮生长因子;抑制作用

　　Research of the effect of octreotide on cultured A375 melanoma cell lines GuiQin Liu,FangWei YingFoundation item: Shenzhen Science and Technology Plan Project, China (No.200702088)，Shenzhen Eye Hospital, Shenzhen 518040, Guangdong Province, ChinaAbstractAIM: To understand effects of octreotide on vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion in cultured A375 melanoma cells.

　　METHODS: A375 cells in vitro amplificated were cocultured with octreotide of concentration 5,1 and 0.2mg/L for 24,48 and 72 hours.Whether octreotide affected the proliferation of A375 melanoma cells was tested by MTT methods. The octreotide effects on VEGF secretion in A375 cells were tested according to the ELISA method, and octreotide effects on cultured A375 melanoma cell line proliferation and VEGF secretion were statistically analyzed.RESULTS: Twentyfour hours after coculture, octreotide improved the A375 cell proliferation (F=14.180，P=0.00). The concentration and time of octreotide coculture with A375 cells in vitro affected the VEGF secretion significantly (content factor：F=24.441，P=0.00;time factor：F=127.233，P=0.00).Octreotide of the three concentrations improved VEGF secretion in A375 cells in 24 hours.The higher concentration, the less in crease of VEGF level(Oneway analysis of variance:F=19.489，P=0.00),and octreotide decreased VEGF secretion in A375 cells in 72hour,the inhibiting power accorded with the concentration(Oneway analysis of variance:F=16.116，P=0.002).CONCLUSION: Octreotide inhibition on VEGF secretion in A375 melanoma cells is a longterm trend and in a dosedependent manner.

　　

　　KEYWORDS: octreotide; melanoma; vascular endothelial growth factor; inhibition0　引言

　　黑色素瘤组织中有大量的肿瘤血管，对肿瘤的生长有重要的作用，生长抑素对神经内分泌肿瘤等肿瘤血管具有一定的生成抑制作用，研究初步阐述生长抑素奥曲肽对体外培养的黑色素瘤细胞株A375分泌血管内皮生长因子(VEGF)作用的影响。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　A375细胞株(中科院上海生物研究所提供利用含150mL/L胎牛血清的DMEM完全培养基培养并扩增)，DMEM培养基(GIBCO)，胎牛血清(杭州四季青)，奥曲酞(山东中天)，酶标仪(THAM)。

　　1.2　方法

　　1.2.1　奥曲酞对A375细胞增殖作用的测定

　　取处于对数生长期的A375细胞，800r/min离心5min，弃上清，加入DMEM完全培养液，调整细胞密度至109/L,各取200μL细胞悬液加入到96孔培养板，按照分组在各孔中加入奥曲酞，浓度分别为0(对照组)，5，1，0.2mg/L，每组5个复孔。将培养板置于37℃，50mL/L CO2培养箱培养24，48，72h后每孔加入5g/L MTT液20μL，继续培养4h后，吸除培养液，加入二甲基亚砜200μL，充分混匀，在酶标仪上测定每孔的吸光度A值，波长为492nm。表1 奥曲酞对A375细胞增殖作用(略)

　　1.2.2　奥曲酞对A375细胞分泌VEGF作用的测定

　　制备检测样品：109/L A375细胞悬液各取200μL加入96孔培养板，分别加入奥曲酞浓度分别为0(对照组)，5，1，0.2mg/L，每组5个复孔，置于37℃，50mL/L CO2培养箱培养24h后，吸出培养液上清。在酶标板上分别设定空白孔，含1000～15.6ng/L VEGF的倍比稀释共7个标准样品孔，及培养24h后的对照组样品孔，3组不同奥曲浓度的样品孔，各加入相应的样品溶液100μL，37℃反应120min后，弃去液体并在每孔加入检测溶液A 100μL，37℃反应60min，之后洗板3次，每次2min，甩干后每孔加入100μL检测溶液B，37℃反应60min，再次洗板5次，每次2min，甩干后依序每孔加入底物溶液90μL，37℃避光反应20min后加入终止溶液50μL终止反应，用酶标仪在450nm测量A值。按照倍比稀释的7个标准品的VEGF浓度为横坐标，A值为纵坐标绘出标准曲线，并用直线回归方程式，根据前样品的A值计算出样品的VEGF浓度。

　　统计学分析：利用SPSS 13.0系统处理数据。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　奥曲酞对A375的作用 体外共培养24h后，奥曲酞对A375细胞增殖有显著促进作用(F=14.180，P=0.00)，其中5mg/L奥曲酞最为明显，与其他浓度相比均有显著性差异(P<0.05);而培养48h及72h则不明显。

　　2.2　奥曲酞对A375细胞分泌VEGF的作用

　　标准品的浓度与相应的OD450呈线性正相关(r=0.991，P<0.01)，有统计学意义。经过线性回归，拟合回归方程为：浓度=0.08018+6.325×104 OD450;残差标准差为0.014(t=5.779, P=0.01);回归系数标准差为0.000(t=18.610，P<0.01)，均有统计学意义。奥曲酞与A375细胞体外共培养24，48及72h后培养上清样品测量的450nm的A值的均数通过回归方程计算出对应的各样品的VEGF平均含量如表1。奥曲酞浓度及作用时间对体外培养的A375细胞分泌的VEGF含量有显著性影响(浓度因素：F=24.441，P=0.00;时间因素：F=127.233，P=0.00)。无奥曲酞的对照组A375细胞分泌的VEGF含量在24～72h期间较平稳，无显著性差异;而不同浓度的奥曲酞与A375细胞共培养后24h均呈现明显的增加细胞分泌VEGF的作用，但不同浓度的奥曲酞的影响有差异性(单向方差分析F=19.489，P=0.00);随着作用时间的延长，细胞分泌VEGF逐渐减少，并在72h显示出各浓度的奥曲酞均明显抑制A375细胞分泌VEGF，不同浓度的奥曲酞的抑制作用有显著差异性(单向方差分析F=16.116，P=0.002)。

　　3　讨论

　　黑色素瘤是眼科常见的恶性肿瘤，瘤的组织中有多量大小不等的新生血管存在，供养着肿瘤细胞的生长。目前的治疗方法主要为手术摘除眼球，结合放疗，以及其他包括光凝、冷冻、光化学疗法等辅助方法，还有近年来迅速发展起来的肿瘤生物疗法等。肿瘤自身血管系统形成是实体瘤生长和转移过程中至关重要的步骤。肿瘤血管生成是肿瘤细胞、血管内皮细胞与其微环境相互影响的结果，每一步都涉及到血管生成因子与血管生成抑制因子之间的调节失衡[1]。肿瘤细胞自身分泌促进血管生成的因子可诱导肿瘤血管生成，而一些内源性血管生成抑制因子可通过抑制肿瘤血管生成促使肿瘤处于休眠状态。抗肿瘤血管生成已成为当前肿瘤研究领域中新的热点，受到广泛的关注。近年来研究发现生长抑素及其类似物对肿瘤血管生成具有抑制作用[2]，但生长抑素对黑色素瘤的作用研究目前尚未见报道。研究生长抑素奥曲酞与黑色素瘤细胞A375共培养对细胞的增殖及VEGF的分泌作用的影响，结果发现在培养24h后A375瘤细胞的明显增殖，药物对细胞分泌VEGF有促进作用，之后VEGF的分泌则逐渐降低，而促细胞增殖作用消失，在培养72h后奥曲酞对A375分泌完全呈现抑制作用，药物浓度越高，抑制作用越明显，呈现抑制细胞分泌VEGF的时间和剂量依赖作用。在奥曲肽对培养A375瘤细胞在24h有明显增殖作用，较高浓度的奥曲肽促增殖作用更明显，同时对细胞分泌VEGF有促进作用，较高浓度药物促进作用反而较小，可见奥曲肽对A375细胞的促增殖作用是短暂的，而较高浓度奥曲肽引起的较多数量的A375细胞的VEGF分泌并为同等增加，单位细胞分泌VEGF的数量反而是较少的。奥曲肽对黑色素瘤细胞A375分泌VEGF长期的趋势上是抑制作用，与时间和剂量呈依赖关系。黑色素瘤组织中肿瘤血管的生成是受多种因素影响的复杂过程，目前只对生长抑素奥曲酞的体外抑制分泌VEGF进行了初步的研究，今后应该逐步研究活体中生长抑素对黑色素瘤血管生成的作用，将其与传统的手术、放疗和化疗联合应用，可能会产生良好的治疗效果，将为黑色素瘤的治疗提供可喜的前景。

　　【参考文献】

　　1　邱达泰，黄芝，欧阳高亮，等.肿瘤血管生成促进因子和抑制因子.中国药物与临床2005;5(7)：485488

　　2　英卫东，许戈良.生长抑素抑制肿瘤血管生成的研究进展.国外医学外科学分册2003;30(6)：334336