人类防御素在眼科的研究进展

作者：辜臻晟，盛耀华作者单位：上海交通大学医学院附属新华医院 眼科，上海 200092 【摘要】  人类防御素是一类阳离子抗微生物肽大家族，分子量为4~5 kDa，分子内含有6个二硫键相连的半胱氨酸残基。近年来，随着防御素的发现和研究，其广泛的抗微生物特性受到人们的关注，有可能成为一条新的抗感染途径。防御素已成为医学生物学和分子生物学研究的热点。本研究主要就防御素的结构特点、眼组织分布、眼表上皮表达与调控、生物学活性等相关研究进展进行综述。 【关键词】  抗微生物肽；人类防御素；Toll样受体；细胞因子    植物、无脊椎动物和脊椎动物为了躲避自然界众多有害微生物的侵袭，均具有发达的特定防御机制。各种物种产生一系列小型肽构成宿主的早期防御屏障。这些小型肽表现出广谱抗微生物活性，故被命名为抗微生物肽。防御素正是其中的一类大家族。防御素是一种阳离子多肽，分子量为4~  5 kDa，富含二硫键，表达于哺乳动物、昆虫和植物中。在防御素蛋白分子中，精氨酸含量丰富，具有6~8个保守的半胱氨酸残基，形成3~4个分子内二硫键。根据半胱氨酸的空间分布和二硫键连接方式的不同，防御素家族可分为α、β、θ等亚型[1,2]。这一家族中β-防御素在种系发育上比α-防御素更为古老。目前，已发现6种人类α-防御素（human defensins，HD），即中性粒细胞肽-1~4（HNP-1~HNP-4）、HD-5和HD-6，以及11种人类β-防御素（HBD）。它们均参与人类的先天性免疫。    防御素具有多向生物学活性。其一，防御素通过对微生物表面膜的穿透，可以快速、非特异地杀灭细菌、真菌和被膜病毒等病原微生物。杀菌机制为防御素带正电荷，具有双向亲和性，易与细胞膜脂性双分子结合，形成多聚体孔，导致细胞内液渗漏，细胞死亡。其二，防御素协助机体产生获得性免疫，激活细胞免疫和体液免疫，趋化单核细胞，杀灭并清除病原微生物。    1  人类防御素的眼部分布    1.1  人类防御素在眼组织的检测    为了探究人类防御素在眼部的分布以及在眼组织先天性防御机制中的作用，国外众多学者进行了相关研究。1998年，Haynes研究小组[3]利用尸体眼和捐献眼进行了眼表组织防御素检测，结果发现HNP-1~HNP-3可在正常泪液、泪腺和炎性结膜中找到，HBD-1可在结膜、角膜和泪腺中表达，HBD-2的信息也在角、结膜组织中显示，泪腺中则未找到。而HD-5和HD-6的信息在眼表组织中无反映。Paulsen等[4]检测了人的鼻泪管组织，他们观察到HNP-1~HNP-3存在于所有样本中，而HBD-1仅在某些健康的上皮组织和炎性组织中表达。HBD-2则出现于炎症样本中。Zhou等[5]也发现在眼表手术之后，泪液中HNP-1~HNP-3的表达明显上调。Lehmann等[6]和Haynes等[7]的课题小组又分别对眼前段组织和内眼组织中防御素的分布进行了分析。他们发现HBD-1既表达于眼内，也表达于眼外，而HBD-2局限于在眼表表达，且HBD-1的表达水平往往高于HBD-2。RT-PCR显示，HBD-1组成式表达于虹膜、睫状体、晶状体囊膜等上皮组织中；HBD-2在细胞因子的刺激下，可诱导表达于睫状体上皮和视网膜色素上皮。玻璃体和房水的免疫印迹反应表明HBD-1染色阳性，HBD-2染色阴性。

    1.2  人类防御素在干眼患者眼表上皮的表达

    亚临床型炎症是各种类型干眼的一大特征。近来的资料证实在Sj?觟gren’s和非Sj?觟gren’s干眼患者眼表上皮中炎症细胞因子活性增高，细胞表面炎性标志增多[8]。HBD-1组成式表达于角膜和结膜上皮[3,6]。HBD-2表达在人结膜是可变的。

    HBD-2 mRNA在中等干眼患者结膜上皮中表达，但在正常人样本中不表达。HBD-1和HBD-3组成式表达于两组人群中。RT-PCR显示培养的结膜细胞中以白介素-1β(IL-1β)(10 ng/ml)，肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)(10 ng/ml)和灭活的假单胞菌(1×106 cfu)处理后HBD-2 mRNA和蛋白表达上调。HBD-1和HBD-3则无差异[9]。

 HBD-1和HBD-3可能提供基础防护，而HBD-2提供附加的防御，尤其是对眼表遭受损害的干眼人群。由于某些防御素对盐敏感[10]，因而干眼患者较高的泪液渗透梯度可能影响所分泌的防御素活性。但是，干眼患者泪液量的减少可有效提高抗菌剂的浓度。同时，抗菌肽之间的协同作用可对抗高盐浓度效应。所以，在生理情况下干眼患者抗菌效应不会受到明显阻碍。

    眼表泪液的渗透压升高是干眼症的重要特征之一。Narayanan等[11]检测了高渗透压对人角膜上皮表达β-防御素的影响。试验发现高渗压不影响HBD-1和HBD-3组成式表达，也不能诱导HBD-2的表达。应用渗透压500 mOsm/kg的培养液处理角膜上皮细胞24 h，可减弱IL-1β上调HBD-2和IL-6表达的效应。由此，他们推测高渗对β-防御素的基础表达并无影响；然而，高渗环境可调节细胞因子功能，削减防御素产生的细胞迁移和增殖作用，从而影响眼表的防御性炎症反应。

    2  人类防御素眼部表达调节

    2.1  防御素在眼组织表达的调节

    实验证明，HNP-1~HNP-4存在于正常眼表组织，而不表达于正常眼内组织。这一现象的合理解释是：眼部α-防御素HNP-1~HNP-4来源于中性粒细胞、多形核细胞和眼表上皮细胞。眼表组织的α-防御素主要由局部残留的或途经的中性粒细胞释放产生，也可由泪道上皮分泌产生。眼内组织则不然，只有当眼内炎或手术后，由于血—房水屏障的破坏，眼内多形核细胞积聚，α-防御素大量释放，眼内HNP-1~HNP-4的水平才明显升高。HBD-1由眼部上皮组织组成式表达，由于其基因序列缺少NF-κB转录因子调节要件，因此HBD-1不能被炎性激动剂所诱导[12~14]。角膜中HBD-2可被IL－1α，IL－1β，TNF-α等炎症细胞因子以及Gram（＋）、Gram（－）菌及脂多糖等细菌副产物所诱导[15,16]。在眼部抗菌防御机制中，诱导表达的HBD-2可能比组成表达的HBD-1更为重要。

    Toll样受体TLR-2与TLR-1或TLR-6构成共受体，是Gram（＋）菌细胞壁中肽聚糖（PGN）和脂磷壁酸（LTA）等组件的主要受体。TLR-1和TLR-2均表达于原代人角膜上皮细胞和端粒酶永久型人角膜上皮细胞内，而TLR-6 mRNA几乎不能发现。TLR-9是另一种细胞识别受体，也表达于这些细胞。Kumar等[17]证实：角膜上皮细胞由激发的炎症反应表达TLR-2，TLR-1，TLR-6和TLR-9，是Gram（＋）菌的先天免疫受体，对PGN反应，而对LTA无反应。所以数据显示金黄色葡萄球菌是通过TLR-2受体触发角膜上皮的先天免疫反应和随后的炎症反应。在角膜上皮细胞内LTA并不刺激NF-?资B信号，上皮细胞对LTA反应可能是依赖于表皮生长因子受体的交互激活，并不依赖TLRs。

    实验表明，细菌感染诱导角膜上皮细胞内HBD-2的表达升高，主要是通过细胞表面Toll样受体-2（TLR-2）介导[18]。另有实验证实，在角膜纤维母细胞中内，金黄色葡萄球菌组份肽聚糖（PGN）和胞嘧啶-亚磷酸-鸟嘌呤寡核苷酸（CpG-ODN）等刺激因子可诱导α-防御素-3表达，分别由Toll样受体-2（TLR-2）和Toll样受体-9（TLR-9）介导[19]。

    2.2  眼表上皮中HBD-2的表达调控

    IL－1β和TNF－α均刺激人角膜上皮中HBD-2表达，且两者联合刺激效果更明显。IL－1β刺激效应呈浓度（最大10 ng/ml）和时间依赖性（HBD-2 mRNA表达和蛋白分泌最大时间分别是12 h和24 h），在IL－1β移去后HBD-2 mRNA上调至少维持24 h[15]。

    HBD-2基因序列具有3个转录因子NF-κB结合位点，还存在其他几个转录因子结合位点，包括活化蛋白－1（AP-1）和IL-6的核因子。NF-κB活化抑制剂（PDTC，CAPE和MG132）完全阻断IL-1β效应。提示这一转录因子在人角膜上皮细胞中对HBD-2的上调的重要性。SB203580[一种P38分裂原活化蛋白（P38MAP）激酶抑制剂]和SP600125[（一种C-Jun氨基末端激酶（JNK）抑制剂）]均部分抑制IL-1β对HBD-2表达的刺激作用。而PD98059[一种第三分裂原活化蛋白（MAP）激酶途径]即细胞外信号调节激酶（ERK）途径抑制子，不能削弱IL-1β效应。据此推断，IL-1β诱导HBD-2表达可通过P38分裂原活化蛋白激酶，C-Jun NH2－末端激酶和NF-κB途径介导，而且以NF-κB途径占优势[15]。

据发现，Genistein（一种酪氨酸激酶抑制剂）也可削弱IL-1β对HBD-2表达的刺激作用，提示酪氨酸激酶活化也与IL-1β效应相关[15]。

    有关糖皮质激素对防御素表达的影响，各类报道不尽相同。尽管支气管上皮内HBD-1和HBD-2 mRNA暴露于免疫抑制剂（地塞米松）后无改变，但HBD-3 mRNA表达下调[20]。Terai等[21]报道地塞米松可减少人角膜上皮细胞中HBD-1表达。McDermott等[15]（2003）发现在SV40永生型人角膜上皮细胞中HBD-2的上调效应可被地塞米松抑制，并将其对基因转录的影响归结为对NF-κB和AP-1的干预。

    Terai等[21]应用半定量PCR和片断长度诱导扩大多形性检测清楚地证实地塞米松上调HBD-2表达的作用。他们还发现HBD-2表达可被环孢霉素A下调，环孢霉素A对T细胞介导的免疫反应发挥特定的效应，这一制剂可抑制HBDs所产生的天然免疫。

    3  人类防御素对眼组织的生物学作用

    防御素构成了人眼的天然屏障，在抵御外来微生物的侵袭中发挥积极作用。人类防御素具有广谱的抗菌活性，体外试验证明防御素可有效对抗由人眼分离出的各种寄生菌群，包括白色念珠菌、α-溶血链球菌，肺炎链球菌、假单胞杆菌等[22]。取自尸眼角膜上皮组织、原代培养角膜上皮和SV40（猿猴病毒－40）转化的人角膜上皮细胞均有HBD-1和HBD-3 mRNA存在，但HBD-2缺失[15]。由此推测HBD-1和HBD-3提供基础防御避免角膜感染，HBD-3是惟一抗菌活性不受盐浓度影响的人类β防御素[23]，对眼表抗菌尤其有利。眼表部位泪液的盐含量可干扰其他盐敏感的防御素活性。创伤愈合离体培养模型中HBD-2[24]和在体创伤愈合期中r-BD（兔BD-2）表达上调[25]。据观察损伤后1周r-BD－2 mRNA仍上调。眼表被泪水恒定冲刷很可能意味着防御素的实际浓度明显低于离体抗菌活性所需的微摩尔浓度[10，26]。其合理的解释是防御素局限于眼表，附近将产生浓缩效应，使它们的浓度提高到有效水平。此外，防御素与其他抗菌肽（LL-37或CAP37）[27]及溶菌酶等内源性“抗生素”具有协同或附加效应[28~30]。

    防御素可通过趋化单核细胞、树突状细胞和记忆T细胞，促进快速细胞免疫反应[12]。防御素可与溶菌酶、乳铁蛋白等发挥协同作用[28]，并能活化补体[31,32]。不仅于此，防御素通过加快上皮细胞和纤维母细胞的分裂，促进眼表伤口的愈合。相对抗生素而言，防御素还具有非抗原性的特点。最近，Economopoulou等[33]发现α-防御素可通过干扰α-5β-1纤维结合素的相互作用，阻碍血管内皮细胞与细胞外基质黏着，从而抑制病理性视网膜新生血管化。

    4  人类防御素眼科应用前景

    目前，人类抗感染治疗已进入后抗生素时代。临床上滥用抗生素的弊端日益显现，大多数抗生素抗菌谱相对有限，易产生耐药性，因眼表毒性而干扰创口愈合，部分抗生素还会出现过敏反应。寻找一种安全有效、又能长期使用的抗菌药物成为眼科界关注的焦点。防御素正是一种理想的候选药物，它有着抗生素无可比拟的优点。Harder等[23]应用大肠杆菌表达系统获得了重组HBD-2和HBD-3，重组纯化的防御素基于上述生物学作用特点，可能成为对抗眼表感染、预防角膜炎的潜在高效药物。尤其对干眼患者、角膜接触镜配戴者和某些危重昏迷患者预防眼部感染，以及眼部手术后促进上皮愈合，其效用值得期待。

    5  展望与问题

    防御素的天然提取物和人工合成物均证明其具有抗菌谱广谱、抗菌活性高效的特点，为临床抗感染治疗，尤其是眼表抗菌治疗开拓了新的途径。目前，伴随着抗生素的大量使用，耐药菌株不断出现，人们对抗生素的副作用日渐重视。防御素以其独特的抗菌机制而更富吸引力，它较诸多抗生素更有希望成为一种持久性抗菌制剂。近年来，生物信息技术和蛋白重组表达技术的提高，为防御素开发应用提供了可能。

同时，我们也应看到，当前的生物技术尚未达到大批量表达纯化可溶性防御素蛋白的水平，这在一定程度上限制了它的深入研究和广泛应用。防御素对细胞膜的非特异性穿透，提醒我们不应忽视其对正常宿主细胞的毒性作用。然而，我们可以相信，随着生物工程技术的进一步发展，防御素在药理学、抗菌活性和抗菌机制等方面的研发，必将开辟临床应用的新天地。

【参考文献】  [1] Ganz T, Weiss J. Antimicrobial peptides of phagocytes and epithelia[J]. Seminars Hematol,1997,34(4):343-354.

[2] Rodriguez-Jimenez FJ, Krause A, Schulz S, et al. Distribution of new human beta-defensin genes clustered on chromosome 20 in functionally different segments of epididymis[J]. Genomics，2003,81(2):175-183.

[3] Haynes RJ，Tighe PJ，Dua HS. Antimicrobial defensin peptides of the human ocular surface[J]. Br J Ophthalmol，1999,83(6):737-741.

[4] Paulsen FP，Pufe T，Schaudig U，et al. Detection of natural peptide antibiotics in human nasolacrimal ducts[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2001,42(10):2157-2163.

[5] Zhou L，Huang LQ，Beuerman RW，et al. Proteomic analysis of human tears: defensin expression after ocular surface surgery[J]. J Proteome Res，2004,3(3):410-416.