缺氧诱导因子-1α小片段干扰性RNA对人血管内皮细胞缺氧诱导因子-1α表达的调控
发表时间：2009-06-30 浏览次数：697次
作者：蒋剑，夏晓波，许惠卓，熊思齐，刘双珍
作者单位：中南大学湘雅医院 眼科，湖南 长沙 410008 【摘要】 目的 探讨缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）小片段干扰性RNA（siRNA）对人血管内皮细胞HIF-1α表达的影响。方法 构建HIF-1α siRNA重组质粒。将体外培养的人血管内皮细胞（HUVEC-12)分成常氧（20%）组和低氧（1%）组。低氧组又分为对照组、空载体组和HIF-1α组。采用脂质体LipofectamineTM 2000分别转染空载体质粒（空载体组）、HIF-1α siRNA（HIF-1α组），对照组不作转染。采用SP免疫细胞化学法检测各组细胞中HIF-1α蛋白表达的变化，并进行计算机图像分析。结果 对照组和空载体组细胞HIF-1α蛋白表达较常氧组增强，而HIF-1α组较对照组明显减弱。结论 HIF-1α siRNA能显著抑制HIF-1α的表达，为视网膜新生血管的基因治疗提供了新方法。 【关键词】 缺氧诱导因子-1α；RNA干扰；血管内皮细胞 新生血管可发生在炎症、创伤、肿瘤等病变过程中，但眼内新生血管形成主要与缺血、缺氧有关[1]。研究发现，缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在缺氧环境中转录活性增高，并上调受其调控的促血管生成物质[2,3]。本实验应用针对HIF-1α的小片段干扰性RNA（small interference RNA，siRNA）转染体外培养的人血管内皮细胞，观察其对HIF-1α的抑制效果，探讨今后用于抑制视网膜新生血管的可行性。 1 材料和方法 1.1 主要试剂 pSUPER.retro空载体质粒(美国Oligoengine公司)，脂质体LipofectamineTM 2000（美国Invitrogen公司），山羊抗鼠HIF-1α多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），SP免疫组化试剂盒及DAB显色剂（北京中山生物技术有限公司）。人血管内皮细胞HUVEC-12、DMEM培养基（低糖型）、胎牛血清购自中南大学湘雅医学院细胞中心。 1.2 HIF-1α siRNA重组质粒的构建 根据人类基因库中人HIF-1α基因的mRNA序列设计siRNA作用靶点，其靶序列为AAGAGGTGGATATGTCTGG。化学合成64nt的sh-HIF-1α（HIF-1α小发夹RNA）寡核苷酸序列并退火形成双链模板。采用Hind Ⅲ和BglⅡ双酶切pSUPER.retro空载体质粒，然后与退火形成的双链模板体外连接，经转化﹑筛选等步骤后抽提重组的HIF-1α siRNA重组质粒。并测序鉴定重组质粒中sh-HIF-1α寡核苷酸插入序列的准确性。 1.3 细胞培养及分组 人血管内皮细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，预先在37℃，5% CO2，20% O2环境中培养24 h，使细胞进入对数生长期后，更换新鲜培养液，再将细胞分别置于常氧（正常组）和低氧（低氧组）环境中培养16 h。低氧培养是把细胞置于1% O2，5% CO2和94% N2混合气体的条件下培养。低氧组又分为：对照组、空载体组和HIF-1α组。 1.4 基因转染 转染前24 h将1×106细胞接种于6孔板内，当细胞达到90%~95%融合时即可进行转染。在1.5 ml离心管中准备A、B液。A液：250 ?滋l无血清DMEM培基＋4 ?滋g质粒；B液：250 ?滋l无血清DMEM培基＋10 ?滋l脂质体。A、B液轻摇，于室温下放置5 min。然后将以上A、B液混合，于室温下放置20 min。用PBS洗涤细胞2次，将A、B混合液加入6孔板中，轻摇使之与细胞充分接触，6孔板中加入2 ml无血清DMEM培基。37℃培养6 h，弃去培养液，更换不含抗生素的完全培养基。空载体组转染空载体质粒pSUPER.retro，HIF-1α组转染HIF-1α siRNA重组质粒，对照组不作转染。 1.5 SP免疫细胞化学法 预先将盖玻片放入6孔板内，细胞转染24 h后，将正常组和低氧组细胞分别置于常氧和低氧环境中继续培养16 h。4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS洗5 min；0.1%Triton-X100作用10 min以增加细胞膜的通透性，PBS洗3次，每次3 min；0.3%H2O2作用10 min，PBS振洗2次，每次3 min；正常兔血清封闭15 min，弃去正常兔血清，滴加HIF-1α一抗（1：100），湿盒内4℃过夜；PBS振洗3次，每次3 min；滴加生物素化二抗，孵育15 min；PBS振洗3次，每次3 min；滴加辣根酶标记的链霉卵蛋白素工作液，孵育15 min；PBS振洗3次，每次3 min；DAB显色，常规逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。PBS代替一抗作空白对照。结果观察：显微镜下阳性判断为细胞胞核出现棕黄色颗粒。采用 Motic images advanced software 3.2进行图像分析，高倍镜下随机选取10个视野（n），对细胞阳性信号进行灰度值测定，着色越浓、阳性信号越强则灰度值越低。 1.6 统计学方法 应用SPSS11.5统计软件包对实验数据进行统计学分析。各组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。 2 结果 HIF-1α蛋白阳性表达为细胞胞核出现棕黄色颗粒。正常组细胞HIF-1α蛋白未见明显阳性表达（见图1），对照组和空载体组细胞为强阳性表达（见图2，3），而HIF-1α组表达减弱（见图4）。各组间差异有显著性（P<0.01）（见表1），其中对照组和空载体组与正常组相比差异有显著性（P<0.01），对照组与空载体组比较，差异无显著性（P>0.05）；HIF-1α组与对照组比较，差异有显著性（P<0.01）。 3 讨论
大量研究表明HIF-1在新生血管的发生过程中扮演着上游转录因子的角色。HIF-1为一由HIF-1α和HIF-1β亚单位构成的异二聚体，HIF-1α是惟一的氧调节亚单位，它决定HIF-1的活性，氧对HIF-1活性的调节主要通过该亚基起作用。常氧条件下，HIF-1α蛋白极易被泛素—蛋白水解酶复合体降解，半衰期小于10 min，抑制蛋白水解酶复合体或缺失泛素依赖酶均能阻断这一过程；低氧条件下，HIF-1α降解过程被阻断，HIF-1α在细胞内堆积，进入细胞核与HIF-1β形成HIF-1复合物，此时，HIF-1α转录活性提高，与协同转录激活因子CBP/p300通过低氧反应元件共同促进诱导性一氧化氮合酶、内皮素-1、表皮生长因子、血管内皮生长因子及受体[4]、血小板源性生长因子-B的表达[5]，它们在血管生成过程的不同环节发挥着作用。
RNA干扰在抑制基因表达方面具有特异性强、高效性、副作用小等优点，已被国内外学者用于多项实验研究。RNA干扰的机制是外源性双链RNA降解与其有同源序列的mRNA，导致其相应的基因沉默[6]。RNA干扰在起始阶段，加入的小分子RNA被一个称为Dicer[7]的酶切割为21~23核苷酸长的小分子干扰RNA片段[8]；在效应阶段，小干扰RNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物[9]，从而特异性地抑制靶基因的表达。本实验采用的HIF-1α siRNA重组质粒是在载体质粒H1启动子的下游插入了一个能编码针对HIF-1α的小发夹状RNA（shRNA）片断构建的，转染细胞后shRNA被加工成siRNA，从而引起干扰效应。
我们采取低氧培养细胞的方法，以模拟体内缺氧环境。按照Takahashi等[10]的方法，基因转染细胞24 h后，低氧培养16 h，再检测基因的表达。本实验中，正常组细胞未见明显HIF-1α蛋白阳性表达，说明HIF-1α蛋白在常氧条件下基本被降解。缺氧16 h后，对照组和空载体组细胞HIF-1α蛋白呈强阳性表达，主要表达于胞核，可见HIF-1α蛋白被缺氧诱导，降解受阻，从胞浆进入胞核。当HIF-1α siRNA转染细胞后，HIF-1α蛋白表达较对照组有明显减弱，因而证实了HIF-1α siRNA能有效抑制HIF-1α的表达；另一方面HIF-1α siRNA在缺氧环境中亦能发挥RNA干扰效应。我们推测，HIF-1α siRNA同样能在视网膜新生血管活体实验中抑制HIF-1α的表达，达到抑制新生血管形成的目的，但转染途径及如何提高转染效率有待进一步研究。
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