密蒙花提取物治疗兔去势所致干眼症

作者：姚小磊作者单位：湖南中医药大学附属第一医院 眼科，湖南 长沙 【摘要】  目的 观察密蒙花提取物对去势所致的干眼症雄兔基础泪液分泌量，泪腺局部炎症因子转化生长因子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的影响，探讨密蒙花提取物抗雄激素水平下降所致的干眼症的作用机制。方法 将30只日本大耳雄兔随机分为空白组（A）、模型组（B）、1倍剂量密蒙花提取物治疗组（C）、2倍剂量密蒙花提取物治疗组（D）和染料木黄酮治疗组（E），每组6只，对B、C、D、E组行雄激素去势术建立动物模型，对C、D、E组分别以密蒙花提取物1倍剂量和2倍剂量以及染料木黄酮连续灌胃1个月，对全部实验兔行Schirmer I试验，采用免疫组织化学方法，对兔泪腺组织中炎症因子TGF-β1、IL-1β、TNF-α进行检测。结果 C、D、E组Schirmer I试验测量值明显高于B组（P<0.01），在泪腺导管及腺泡上皮细胞中，IL-1β、TNF-α阳性表达的细胞数均明显低于B组，而TGF-β1阳性表达的细胞数均明显高于B组（P<0.01）。以上检测结果C、D组均优于E组（P<0.05）。结论 密蒙花提取物中主要成分为黄酮类物质，可显著抑制雄激素水平降低后兔干眼症的发生。其作用机制可能与黄酮类物质化学结构与雄激素类似，可起到拟雄激素效应，从而调节泪腺局部炎症反应有关。密蒙花提取物可能成为治疗干眼症的新途径。 【关键词】  去势 干眼症 泪腺 密蒙花提取物    干眼症是指由于泪液的量或质的异常引起泪膜不稳定和眼表损害而导致的一组眼不适症状。眼部和（或）全身多种原因引起的泪腺特征性病理改变为泪腺组织灶性淋巴细胞浸润增殖，腺体组织进行性破坏，致使腺体分泌功能下降甚至丧失[1]。近年来国内外研究表明，性激素，尤其是雄激素；水平下降后，对泪腺调节作用异常，导致泪膜不稳定、局部炎症反应加重，最终导致干眼症。研究证明密蒙花花蕾中可分离得到8个黄酮类化合物，黄酮类化合物化学结构与雄激素类似，可能起到拟雄激素活性作用，在治疗性激素水平下降导致干眼症方面起到独到的效果。我们制作去势兔干眼症模型，测定其给药前后基础泪液分泌量、泪膜稳定性变化，对其泪腺组织标本进行局部炎症反应因子表达的研究，旨在探讨密蒙花提取物对抗性激素水平下降导致干眼症的作用机制以及治疗效果。    1  材料和方法    1．1  实验动物及分组  2月龄日本大耳雄兔30只，体重2.0~2.5 kg，由湖南中医药大学动物实验室提供。裂隙灯显微镜和眼底镜检查眼前节及眼底无异常，0.5%的卡因眼液表面麻醉后Schirmer I试验（Schirmer I test，SIT）≥10 mm/5 min和泪膜破裂时间（breakup time，BUT）≥10 s的动物方可使用。将这30只白兔随机分为空白组（A）、模型组（B）、1倍剂量密蒙花提取物治疗组（C）、2倍剂量密蒙花提取物治疗组（D）、染料木黄酮治疗组（E），每组6只。1．2  实验药物  密蒙花提取物干粉（湖南雅龙生物工程有限责任公司提供），制作方法是取密蒙花干燥花蕾20 kg，用70%乙醇提取两次，第一次加入8倍量，第二次加入6倍量，合并乙醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，将浓缩液真空干燥，粉碎。将粉末用乙酸乙酯提取三次，每次加入6倍量，合并乙酸乙酯提取液，常压回收乙酸乙酯，将浸膏真空干燥，粉碎即得。对照药物选用纯度98%的染料木黄酮干粉（湖南九汇现代中药有限公司提供）。

    1．3  主要试剂  5%BSA封闭液，山羊（或鼠）抗兔转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β），肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）多抗，生物素化山羊抗兔IgG，过氧化物酶标记链酶白卵素（Strept Avidin-Biotin Complex，SABC）免疫组织化学试剂盒，3，3-二氨基联苯胺（3，3-      diaminobenzidine，DAB）显色剂(以上试剂均由武汉博士德生物工程有限公司提供)。1.4  实验方法  行双侧睾丸切除术（Orchiectomy，ORX）制作雄激素水平下降所导致的干眼症模型：将B、C、D、E四组实验兔手术切除睾丸及附睾。A组只切开阴囊，不切除睾丸，术后预防感染。A、B组每日以8.5 g/L生理盐水5 ml灌胃，C组每日以密蒙花提取物按体重50 mg/(kg·d)灌胃，D组每日以密蒙花提取物按体重100 mg/(kg·d)灌胃，E组每日以染料木黄酮按体重50 mg/(kg·d)灌胃。每组均灌胃4周。

    1．4.1  SIT检查基础泪液分泌量[2]  在给药前及最后一次给药后，SIT检查泪液基础分泌情况。方法是取5 mm×35 mm有刻度的试纸，一端反折5 mm，轻轻放入被测眼下结膜囊的中外1/3处，5 min后取出滤纸，测量湿长。一般≥10 mm/5 min为正常，模型组兔均≤9 mm，治疗组兔均≥10 mm。

    1．4.2  免疫组化法检测TGF-β1、IL-1β、TNF-α  的表达  每组兔均以空气栓塞法处死后立即取双眼泪腺组织，泪腺直径约4 mm，即刻将泪腺组织剪成大小两部分。较大的一部分予以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，每组石蜡块予以Shandon325型石蜡切片机连续切片，常规脱蜡至水，以免疫组织化学法检测TGF-β1、IL-1β、TNF-α的表达，显微镜观察，Motic B5显微摄像系统进行摄像。较小的另一部分予以2.5%戊二醛前固定。采用MIAS-1000型高清晰度彩色病理图文分析系统中的免疫组化测量系统。以2．105 μm为像素点长。在1．271×106 μm2窗口面积下测量炎症因子TGF-β1、IL-1β、TNF-α的平均光密度值，行半定量分析。并随机统计各组5~7个高倍视野(400倍)中的凋亡细胞总数，计算每高倍视野下的平均细胞数。

    1．4.3  电镜观察超微组织结构变化  每组样本从2.5%戊二醛固定液中取出后，以日立H-600透射电镜观察泪腺组织超微结构变化。

    1．5  统计学方法  用SPSS13.0软件进行统计分析。各组SIT测量值治疗前后比较，使用配对t检验；如不满足正态性，则使用符号秩和检验。SIT各组间治疗后比较，以治疗前测量值为协变量，使用协方差分析。各组炎症因子TGF-β1、IL-1β和TNF-α平均光密度的比较，使用多元方差分析。

    2  结果

    2．1 基础泪液分泌量比较  灌胃前和灌胃4周后各组SIT测量值见表1。经协方差分析，各组治疗后SIT测量值比较差异有显著性（F＝34.187，P<0.01）。雄兔模型组（B）去势后生理盐水灌胃4周，基础泪液分泌量明显减少，滤纸湿长缩短，与去势后灌胃前有明显差异（t=17.033，P<0.01），C、D组去势后密蒙花提取物灌胃4周，基础泪液分泌量稳定，与去势后灌胃前比较差异无显著性（t＝1.195，t=0.349，P>0.05）。其中，C、D组滤纸湿长与B组比较增长明显（P均<0.01），E组去势后经染料木黄酮灌胃治疗，基础泪液分泌量虽有增加，滤纸湿长与B组比较增长明显（P均<0.01），但仍未达到去势前分泌状态，与空白组比较有明显差异（P<0.01）。

    2．2  泪腺局部炎症反应比较  A组雄兔泪腺组织排列整齐，未见细胞变性坏死，未见纤维组织增生及炎性细胞浸润。TGF-β1、IL-1β与TNF-α表达均不明显。B组雄兔去势后4周，泪腺组织排列紊乱，可见大量腺泡细胞变性坏死，坏死灶纤维组织增生，局部大量炎性细胞浸润。TGF-β1表达不明显，IL-1β与TNF-α大量表达于细胞膜和细胞浆中，呈棕黄色颗粒（见图1~图3）。C、D组雄兔经密蒙花提取物治疗后，泪腺组织镜下观较模型组好转，细胞变性数量减少，局部炎性细胞浸润不同程度减轻。TGF-β1表达增强，可见其大量表达于细胞膜和细胞浆中，呈棕黄色颗粒，IL-1β与TNF-α表达较B组减弱（见图4~图6）。E组雄兔经染料木黄酮治疗效果不明显，镜下观虽较B组好转，但仍可见细胞变性及坏死，部分切片仍可见炎性细胞浸润，可见TGF-β1明显表达，也可见IL-1β与TNF-α大量表达于细胞膜和细胞浆中，呈棕黄色颗粒（见图7~图9）。

 采用电子计算机图像分析技术检测各组泪腺细胞TGF-β1、IL-1β、TNF-α染色的平均光密度值，经多元方差分析，结果表明：各组的TGF-β1、IL-1β、TNF-α表达组间比较差异均有显著性（FTGF-β1＝6.777，FIL-1β＝36.805，FTNF-α＝34.403，P均<0.01）。其中，雄兔模型组（B）去势4周后IL-1β、TNF-α明显增强，与A组比较有明显差异（均P<0.01），C、D组去势后经密蒙花提取物灌胃治疗，TGF-β1表达较B组增强（P<0.05，P<0.01），IL-1β、TNF-α表达减弱 （P均<0.01）；E组去势后经染料木黄酮灌胃治疗，TGF-β1表达与B组比较无显著性增加（P>0.05），且IL-1β、TNF-α表达仍然较强，与B组无明显差异（P均>0.05），见表2。

    2．3  透射电镜观察结果  空白组（A组）：整个组织结构较好，泪腺上皮细胞内线粒体结构清晰，未见明显嵴丢失，核圆，核膜未见明显皱缩，未见炎性细胞。

    模型组（B组）：泪腺上皮细胞变性，局灶有坏死。胞浆内分泌颗粒电密度降低甚至溶解，呈脱颗粒现象，线粒体嵴丢失、空泡变，内质网轻度扩张，部分泪腺上皮细胞内出现较大的空泡，核膜皱缩，染色质块状分布（见图10），可见较多炎性细胞。

    1倍剂量密蒙花提取物治疗组（C组）：泪腺组织轻度水肿，未见坏死细胞，细胞水肿，泪腺上皮细胞内分泌颗粒丰富，仍有丝状改变，线粒体空泡变减轻，核膜轻度皱缩，边集不明显（见图11）。间质增宽，胶原纤维增多，间质内有少量炎性细胞。

    2倍剂量密蒙花提取物治疗组（D组）：组织结构较完整，未见坏死细胞，泪腺组织未见水肿。泪腺上皮细胞内分泌颗粒比较丰富，未见丝状改变，线粒体空泡变减轻，核较圆，膜轻度皱缩，染色质分布均匀，未见炎性细胞。

    染料木黄酮治疗组（E组）：整个组织结构较好，胞浆内线粒体嵴丢失较模型组减轻，分泌颗粒电子密度较低。核膜仍有轻度皱缩，染色质分布较均匀（见图12），间质内有少量炎性细胞。

    3  讨论

    对因治疗是任何疾病治疗的最佳方法。对于雄激素水平下降导致的干眼症，治疗关键无疑就是雄激素替代治疗。雄激素补充治疗虽然有效，但长期应用会造成许多不必要的副作用，因此，寻找一种雄激素替代药物，是眼科工作者亟待解决的一个问题。

    3．1  密蒙花提取物及其一些特性  眼是性激素作用的靶器官，已证实雄激素、雌激素、孕激素和催乳素受体广泛存在于人、兔和鼠的泪腺、睑板腺、角膜等眼表组织中[4]。密蒙花提取物中含有大量黄酮类物质，Nifli等[5]利用放射性示踪标记的方法研究还表明黄酮类物质是细胞膜雄激素受体的刺激物，可以与细胞膜雄激素受体结合发挥生物学效应，因此，密蒙花黄酮同样也可能与这些受体结合而发挥作用。

    由于雄激素、黄酮类物质均为杂环多酚类化合物，可以利用其化学结构的相似性，维持体内雄激素的正常水平，治疗某些雄激素水平下降导致的疾病，从而直接有益于雄激素水平下降所导致的干眼症。研究已证明某些黄酮类化合物具有拟雄激素作用[6]。Moyad[7]发现黄酮类物质不但对于治疗围绝经期妇女的骨质疏松有效，甚至对于因为前列腺癌采取雄激素剥夺疗法的男性患者的骨质疏松也有效。除此以外，Wu等[8]通过动物实验也发现染料木黄酮能够减少雄激素水平下降引起的骨质丢失。从上文可知，密蒙花提取物因其有高含量的黄酮类物质，所以可能直接产生拟雄激素活性作用，从而治疗干眼病。

    3．2  密蒙花提取物对兔泪腺局部炎症反应的影响

    泪腺局部炎症反应加重是雄激素水平下降所导致的直接后果，也是干眼症发病的重要机制。Sullivan等[9]研究发现，雄激素水平的降低可促进Sj?觟gren’s综合征（Sj?觟gren’s syndrome，SS）的进程并加重与之相应的泪腺的炎症以及睑板腺的功能障碍和干眼症症状。Toda等[10]的研究表明，雄激素治疗能增加雌性MRL/lpr鼠泪腺组织中TGF-β1的mRNA的水平，以及促进TGF-β1蛋白的聚集，而且TGF-β1量的增加能降低泪腺组织中IL-1β和TNF-α的mRNA的水平。这表明雄激素不但可通过细胞因子TGF-β1对眼的免疫反应进行调节，而且还可以抑制泪腺的免疫性损害[11]，减轻泪腺炎症。另外，2001年Solomon等[12]还发现干眼症患者泪膜和结膜IL-1β含量明显高于正常人。

本实验研究表明，通过密蒙花提取物的干预，C、D组泪腺组织中TGF-β1表达显著提高，从而使IL-1β和TNF-α显著降低。IL-1和TNF-α是最重要的促炎因子[13]，因此减轻了泪腺局部的炎症反应，炎性细胞浸润消失，正常泪腺细胞得到保护，受损组织得以修复。对于雄兔来说，这可能与密蒙花提取物中黄酮类物质具有拟雄激素作用有关，黄酮类物质与泪腺组织中雄激素受体结合后，提高泪腺组织中TGF-β1的mRNA的水平，以及促进TGF-β1蛋白的聚集，从而进一步抑制促炎细胞因子IL-1、  TNF-α等的生成，促进组织修复，与Toda等[10]的实验结果相符合。而E组雄兔予以染料木黄酮干预，TGF-β1表达虽有提高，但IL-1β和TNF-α降低程度不及密蒙花提取物治疗组，可能是异黄酮类物质拟雄激素作用较密蒙花黄酮差，因此预防效果较差。

    近年来，雄激素在干眼症治疗中的作用逐渐得到重视，被认为是治疗干眼症的新方法。但是单纯应用雄激素治疗，可能会引起一些难以避免的副作用，例如女性男性化、粉刺等等，因此，寻求一种有效的治疗干眼症的雄激素替代品就显得较为重要。密蒙花提取物以其直接或间接拟雄激素的独特作用，可以在干眼症病程中起到独到的作用，值得进一步研究。

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