三七总皂苷对成年地鼠视网膜节细胞存活的影响

作者：魏莉娜， 朱永红， 李海标作者单位：中山大学中山医学院组织胚胎学教研室， 广东 广州 510080 【摘要】  【目的】 探讨玻璃体注射三七总皂苷(tPNS)对视神经切断后视网膜节细胞(RGCs)存活的作用。【方法】 用荧光素逆行示踪标记法和定量解剖学技术观察正常和经tPNS处理的金黄地鼠于视神经切断后5、7、14 d时RGCs的密度。动物分为正常组、单纯切断视神经组（未注射组）、tPNS处理组和生理盐水对照组。【结果】正常RGCs平均密度为(1970 ± 82)/mm2;视神经切断后5、7、14 d时RGCs平均密度分别下降至(983 ± 48)/ mm2、(788 ± 44)/ mm2和(216 ± 37)/ mm2; 生理盐水对照组在各时间点RGCs平均密度与未注射组结果相似; tPNS处理组结果分别为(1363 ± 56)/ mm2、(1169 ± 70)/ mm2和(477 ± 25)/ mm2,与未注射组和生理盐水对照组相比在各时间点上均存在显著性差异(P< 0.05)。【结论】 玻璃体注射tPNS可提高成年地鼠视神经切断后RGCs的短期存活率。 【关键词】  三七总皂苷; 视网膜节细胞; 细胞存活; 成年地鼠 近端切断成年哺乳动物视网膜节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)的轴突，神经元在短期内大量死亡，其原因可能为：细胞内Ca2+超载和自由基的损害；靶源性神经营养因子的缺乏；一氧化氮和兴奋性氨基酸的毒性作用。研究表明，近端切断成年哺乳动物视神经后，单一或联合给予Ca2+通道阻断剂、自由基清除剂、神经营养因子、一氧化氮合酶抑制剂或谷氨酸受体拮抗剂均能在不同程度上提高RGCs的存活率[1-5]。但神经营养因子价格昂贵且只能局部应用，Ca2+通道阻断剂和谷氨酸受体拮抗剂引起的全身副反应大，应用受限。寻求有效的中药治疗是目前研究者们关注的课题。三七总皂苷(total panax notoginseng saponins, tPNS)是五加科人参属植物三七的主要有效成分,是一种受体操纵Ca2+通道阻断剂，具有扩张血管、清除自由基、抗炎、抗氧化等药理作用[6-8]。研究表明，腹腔注射tPNS对轴突损伤后RGCs的存活有促进作用[9]。本实验拟研究玻璃体注射tPNS对轴突损伤后RGCs存活的影响。

    1   材料与方法

    1.1   实验动物及分组

    健康成年金黄地鼠60只, 雄性，体质量80~100 g,中山大学北校区实验动物中心提供。动物随机分为4组(n=6):正常组、单纯切断视神经组（未注射组）、tPNS处理组和生理盐水对照组。后3组按视神经切断后视网膜取材的时间再分为5 d、7 d、14 d的3个时间组。

    1.2   主要试剂及仪器

    tPNS（广西梧州制药集团股份有限公司）,为浅黄色粉末,溶于生理盐水配成200 g/L,保存于－20 ℃。快蓝(fast blue，FB.德国Merck公司),用生理盐水配制为30 g/L 的浓度,4 ℃冰箱避光保存。XTS-4C手术显微镜(镇江光学仪器厂),DMIRB荧光显微镜(Olympus)。

    1.3   手术方法

    玻璃体注射2 μL不同浓度的tPNS或生理盐水后30 min, 距球后1.0 mm处剪断视神经, 复位眼球。在7 d的实验组，再次注射时间为 5 d；在14 d的实验组，补充注射时间为4、7、10 d。玻璃体注射2 μL浓度分别为50、100、150、200 g/L的tPNS，观察其对视神经切断后7 d时RGCs存活的作用，以获取最佳浓度。

    1.4   RGCs的标记与计数

    正常组动物于视神经切断后立即在近侧残端放置沾有FB的明胶海棉，2 d后取材。其余组于取材前2 d再次暴露视神经，将近侧残端剪短至0.5 mm,同上标记。

    取材时在致死量麻醉状态下取出眼球，置于40 g/L多聚甲醛(0.1 mol/L磷酸缓冲液,pH=7.3)中剥离视网膜，4 ℃固定1~3 h,按照文献制备视网膜平铺片[10]。荧光显微镜下观察并拍摄视网膜平铺片上FB标记的RGCs,拍摄视野的选择方法参照文献[11],即以视乳头为中心,在通过视乳头的坐标轴上,分别从视网膜鼻上、鼻下、颞上、颞下等距取点,每个视网膜共取24~32个点,用Photoshop 在0.04 mm2方框中计数细胞，重复两次求平均值。所有数据以均值±标准差（ｘ±ｓ）表示，采用SPSS 12.0软件单因素方差分析，检验水准 α=0.05。

 2   结   果

    2.1   正常RGCs密度

    经视神经残端标记的正常RGCs平均密度为(1970 ± 82)/mm2(图1)。细胞胞体为圆形或卵圆形,逆行标记的荧光物质主要分布在神经元的核周质和树突起始部(图1:A)。标记的RGCs在视网膜平铺片上散在分布，且从视乳头中心区到外周区呈现递减趋势(图1:B,C,D)。

    2.2   视神经切断后存活RGCs的密度

    视神经近端切断后,短期内RGCs大量死亡,其密度明显下降,切断后5、7、14 d时RGCs平均密度分别下降至(983 ± 48)/ mm2、(788 ± 44)/ mm2和(216 ± 37)/ mm2，与正常RGCs密度相比，其存活率分别为50%、40%和11% 。

    2.3   tPNS量效分析

    从表1可见, tPNS在50 g/L ~150 g/L时,随浓度增加RGCs密度也增加,当浓度为200 g/L时，RGCs密度未见上升。但tPNS处理组与对照组相比RGCs密度均增加(P< 0.05)。当浓度为150 g/L时RGCs存活达到峰值,故以150 g/L为最佳浓度。

    2.4   tPNS对RGCs存活的影响

    经tPNS处理的动物,切断视神经后5 d、7 d、14 d时的存活RGCs平均密度见表2,与正常RGCs密度相比,其存活率分别为69%、59%和24%。与未注射组相比，5、7 d的RGCs存活率均增加了19%，14 d的存活率增加了13%。生理盐水对照组结果与未注射组结果相近。经单因素方差分析, tPNS组与未注射组和生理盐水对照组相比在视神经切断后不同时间点均有统计学意义(P< 0.05)。

    3   讨   论

    本实验所得正常RGCs平均密度为(1970 ± 82)/mm2，视神经切断后5、7、14 d时RGCs存活率分别为50%、40%、11% ，结果与以往的报道基本相似[11]。端切断成年哺乳动物的视神经可导致RGCs在短期内大量死亡[1]，探讨RGCs死亡原因并提出有效的防治措施是神经生物学研究的重要课题。Ca2＋是神经细胞内重要的信息物质，大量研究表明，胞内Ca2＋超载可导致神经元的死亡，而降低胞内Ca2＋浓度的措施可促进受损神经元的存活[5,12]。

    近来有研究提示，中药对中枢神经系统受损神经元的存活有保护作用[13,14]，其中传统中药三七的神经保护作用很受关注[15-17]。tPNS是五加科人参属植物三七的主要有效成分,是一种受体操纵Ca2+通道阻断剂,具有扩张血管，清除自由基,抗炎,抗氧化等药理作用[6-8]。本课题组以往的研究表明，腹腔注射tPNS可以促进视神经切断后RGCs的存活，5 d、7 d、14 d时RGCs存活率分别提高了13%、12%、5% [9]。但腹腔注射的tPNS通过血液循环到达损伤局部才能发挥作用，影响因素较多，不利于对其机制的探讨。本实验选择玻璃体腔内局部注射的方式，便于tPNS直接作用于受损RGCs，促使其有效发挥保护作用,也便于以后对其作用机制的研究。

    本实验结果表明玻璃体注射tPNS对视神经切断后RGCs的存活有保护作用。与未注射组相比，在视神经切断后5、7、14 d的节细胞存活率分别提高了19%、19%、 13%。其作用在切断后5 d、7 d较14 d时显著。与腹腔注射tPNS对RGCs存活的作用相比，玻璃体注射tPNS在各个时间点均有优势。

    本实验结果还表明，tPNS对受损RGCs的保护作用呈现剂量依赖性，有最佳作用浓度，与人参皂苷有相似性[13]。这可能与其抑制Ca2+内流的机制有关，因为只有合适的胞内Ca2+浓度才能对细胞的生存起促进作用，但确切机制尚需进一步研究。在视神经切断后两周内，tPNS提高受损RGCs存活率的效果显著，提示其短期内对受损神经元有保护作用，其长期作用情况将在下一步实验中进行探讨。

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