重组人表皮生长因子促进动物角膜上皮修复的作用

　　作者：张静,亓晓琳,史伟云,宫华青　　作者单位：(266071)中国山东省青岛市，山东省眼科研究所 青岛眼科医院;2(250021)中国山东省济南市，山东省眼科医院

　　【摘要】 目的：观察表皮生长因子促进损伤动物角膜上皮细胞的修复作用。方法：取健康成年新西兰大白兔和Wistar大鼠，用低浓度乙醇烧灼其双眼中央部角膜，随即用生理盐水冲洗。术后指定右眼为治疗眼，滴用重组人表皮生长因子(epidermal growth factor,rhEGF)，左眼为对照眼，滴用不含rhEGF的赋形剂，每2小时2滴， 6次/d。分别于术后1，24，48，72，120，168h各处死一组动物。新西兰大白兔处死后，取其中央部角膜，对其上皮细胞的微绒毛等超微结构进行观察。并且在扫描电镜下进行随机低倍视野内角膜上皮明、暗细胞的计数。Wistar大鼠处死后取其角膜，使用免疫组织化学方法检测角膜EGFR的表达情况。结果：角膜损伤后随即行裂隙灯检查，发现兔角膜上皮缺损和水肿。术后24h角膜上皮基本恢复正常。扫描电镜下，治疗眼兔角膜上皮的暗细胞数量与其对照眼的差别具有统计学意义(P<0.05)。透射电镜下，治疗眼的兔角膜各层恢复情况优于相应各对照眼。免疫组织化学染色显示rhEGF治疗眼的大鼠角膜上皮以及内皮的EGFR表达水平高于相应对照眼，而且EGFR高表达的时间提前，持续的时间延长。结论：rhEGF可促进角膜上皮的微绒毛修复，对角膜全层的修复有明显的促进作用。

　　【关键词】 表皮生长因子; 角膜.;rhEGF

　　Effect of recombinant human epidermal growth factor on the reparation of corneal

　　epithelium

　　Jing Zhang1, XiaoLin Qi2, WeiYun Shi2, HuaQing Gong1

　　1Qingdao Eye Hospital, Shandong Eye Institute, Qingdao 266071, Shandong Province, China;2Shandong Eye Hospital, Jinan 250021, Shandong Province, China

　　AbstractAIM: To observe the effect of recombinant human epidermal growth factor(rhEGF) on the reparation of corneal epithelium.MEHTODS: New Zealand rabbits and wistar rats were studied. Scanning electron microscope (SEM)and transmission electron microscope(TEM) were used to observe the effect of EGF. The SABC method of immunohistochemistry was used to detect the level of epidermal growth factor receptor(EGFR) in the corneal of Wistar rats.RESULTS: The corneal epithelium was recovered the first day after the trauma under the slit lamp. SEM: The dark cells in EGF group was fewer than the control group (P≤0.05). TEM: The recovery of Each layer of the corneal epithelium in EGF group was better than control group. Immunohistochemistry: The level of EGFR in the corneal of wistar rats in EGF group was higher than that of control group.CONCLUSION: rhEGF can improve the recovery of the injured corneal.

　　KEYWORDS: epidermal growth factor; cornea; recombinant human epidermal growth factor

　　0引言

　　眼表疾病是一种常见的眼前节疾患，其中干眼症，又称为角结膜干燥症(kerato conjunctivitis sicca，KCS)的发病占极重要的地位。所谓干眼症是指由于泪液的质和量或者泪液动力学的异常引起的泪膜不稳定和眼表面损害，从而导致眼部的各种不适[1]。近年来，随着新眼科手术的大量开展，特别是角膜屈光手术，如LASIK术等，术后发生的干眼表现逐渐引起了人们的注意[2]。我们采用了不同浓度乙醇烧灼角膜，引起浅表角膜的损伤，再给予rhEGF滴眼液(金因舒,华生元公司,深圳)点眼，探讨rhEGF对损伤的上皮细胞的修复作用，从而揭示其在眼表损伤中的治疗作用。

　　1材料和方法

　　1.1病理学观察 健康成年新西兰大白兔21只，2000～2500g，雄雌不分，随机分为A组：正常对照组;B组：术后1h组;C组：术后24h组;D组：术后48h组;E组：术后72h治疗眼 对照组

　　全部手术操作由同一人完成。术后1h，取B组动物角膜中央烧灼部分，制作标本。其余5组动物，自术后2h起，右眼(治疗眼)滴用rhEGF眼药水，左眼(对照眼)滴用没有rhEGF的赋形剂，每次2滴，2h/次，6次/d。分别于术后24,48,72,120,168h各处死一组动物。处死前对各组动物进行裂隙灯观察角膜上皮。处死后按照电镜标本制作的常规方法，对标本进行固定、包埋、超薄切片、二重染色后，对角膜上皮细胞的微绒毛、上皮细胞等结构进行电镜观察。使用扫描电镜(日本电子 JSM6701F)在相同的低放大倍率下(600倍)，随机选取60个视野，计数每个视野中明、暗细胞的数目。使用透射电镜(日立H7000，日本)，观察角膜各层结构的变化。

　　1.2角膜EGFR表达 健康成年雄性Wistar大鼠18只， 200g，随机分为A～G 7个组(同前)，每组3只。A组不给与任何处理。其余6组动物行乙醚初步吸入麻醉后，氯胺酮im麻醉。7mm环钻对角膜欲进行烧灼的部位固定后，滴入400mL/L乙醇，烧灼30s，随即用生理盐水冲洗眼。全部手术操作由同一人完成。术后1h取B组大鼠角膜，置于40g/L多聚甲醛中固定24h，80℃冷冻，行冰冻切片、免疫组织化学染色(SABC法)，检测角膜EGFR的表达情况。一抗：兔抗鼠EGFR;二抗：羊抗兔IgG血清。其余5组大鼠，自术后2h起，右眼(治疗眼)滴用rhEGF眼水，左眼(对照眼)滴用没有rhEGF的赋形剂，每次2滴，2h/次，6次/d。分别于术后24,48,72,120,168h各处死一兔角膜暗细胞计数(/600)组动物。取其双眼角膜行免疫组织化学染色，检测角膜EGFR的表达情况。

　　2结果

　　2.1裂隙灯下观察 角膜损伤后的随即检查，发现上皮缺损和水肿。自术后24h后裂隙灯下角膜上皮基本恢复正常。

　　2.2扫描电镜观察 rhEGF治疗眼的兔角膜上皮随治疗时间的增加，损伤呈明显迅速好转的趋势，暗细胞数量逐天减少。对照眼在术后24～72h角膜上皮恢复速度较治疗眼慢。而且，术后120,168h，上皮细胞的结构有向不良方面转化的情况。rhEGF治疗眼与其相对应的各对照眼相比较，可见治疗眼的眼表变化均明显好于对照眼。其中，术后第24,72,120,168h组差别显著。显示出暗细胞表面的微绒毛缺如，暗细胞的数量增多。

　　2.3兔角膜超微结构 rhEGF治疗眼的角膜上皮缺损在24～36h基本恢复完整,角膜表面的微绒毛长浓密，上皮层基底部细胞核随治疗时间的延长，染色质分布均匀。上皮细胞的基底膜与前弹力层连接紧密，基质层细胞及纤维排列方向整齐。对照组在48h时仍可见角膜表面上皮细胞损伤，微绒毛欠损或稀少。前部基质层纤维排列紊乱，可见上皮细胞畸形及线粒体空泡。

　　2.4免疫组织化学染色 rhEGF治疗眼在24h即出现EGFR的高表达，主要表达部位位于上皮层，表达高峰一直持续到72，168h基本恢复正常水平。对照组在24，48h出现EGFR的高表达，72～168h这种表达基本恢复至正常水平。

　　3讨论

　　眼表疾病在日常的眼科工作中占有重要地位，特别是近年来由于电子计算机的普及而导致监视器末端综合征的患者明显增多，其患者多有干眼症的发生。早在50多年前， Sjgren首次描述了KCS。其发病的主要原因是由于泪膜的异常或者眼表上皮的异常，导致了患者眼部的各种不适症状，如干涩感、异物感、烧灼感、畏光、充血、视物模糊、视力波动等，严重者可以导致角膜混浊、溃疡、视力丧失等。而泪膜和眼表上皮的改变是相互作用、相互影响的。眼表上皮的特殊结构是泪膜附着的基础，完整的眼表上皮有利于维持泪膜的张力和稳定性;泪膜是眼表的屏障，泪膜的不完整会损伤眼表上皮，从而加大泪膜正常附着的难度，给眼表上皮带来更加严重的损伤[3]。目前，干眼症的治疗以使用人工泪液反复点眼的对症治疗方法为主[4]，由于其只能在一定程度上缓解症状，并不能够对因治疗，因此疗效不佳。而EGF作为一种强有力的细胞分裂因子，不仅可以促进损伤后细胞的恢复，并可以刺激细胞生长，增加粘蛋白等泪膜成分的分泌，从病因学方面治疗干眼，正广泛的应用于临床[5.6]。角膜上皮是一种非角化的鳞状上皮。根据不同的部位可以分为3种不同形态的细胞：表层的鳞状上皮，中间的翼状细胞和基底的单层柱状细胞。柱状细胞被认为是来自角膜缘干细胞分化的瞬时扩充细胞(transient ampifying cells,TAC)，是角膜上皮中唯一具有分裂功能的细胞。有丝分裂后，翼状细胞向鳞状上皮分化，直至从表面脱落，柱状细胞分化产生上皮基底膜，是上皮与前弹力层牢固附着的基础。上皮细胞可以自我更新，完全更新需要5～7d。角膜上皮表层细胞具有微绒毛和网状微皱襞结构，从而起到支撑和稳定泪膜的功能。角膜上皮表面的扫描电镜显示，表层上皮细胞有明暗两种，细胞表面有较多的网状皱襞是靠近基底的细胞，称为明细胞，相反称为暗细胞，是靠近上皮层面的衰老细胞。在本试验中，治疗眼的暗细胞数均低于对照眼，除一组(48h)差别不够显著以外，其余各组均具有显著的统计学意义(P<0.05)。可见，EGF对于角膜上皮超微结构的恢复有明显的促进作用，这种对于微绒毛和网状皱襞结构的修复，有利于保证泪膜完整和稳定的涂布。对照组的实验结果观察：其角膜上皮暗细胞数量在3d之后呈逐渐上升趋势，而且增幅明显，这说明本次试验设计的损伤角膜的程度可以深及角膜上皮全层，直至基底部的柱状细胞，破坏其分裂的能力;而rhEGF治疗眼则可以修复这种损伤，从而加速角膜上皮的愈合。正常角膜上皮的微绒毛有利于角膜上皮对泪膜各种成分特别是黏液的吸附，从而保证泪膜的稳定性。本研究的透射电镜观察结果，与既往报道的LASIK术后的角膜上皮改变有着共同之处[7.8]，例如，微绒毛数量减少，排列稀疏，上皮细胞排列疏松，间隙增大等。但比以往报道的病变要更轻微，特别是基底部的桥粒连接并未出现明显的变化[9,10]。考虑这种差异可能是由于乙醇的浓度较低而造成轻微的上皮损伤有关。我们在对大鼠角膜EGFR的免疫组织化学染色中，提高了乙醇的浓度，而产生了更为明确的比较效果。rhEGF治疗眼的各组EGFR的表达均高于相应对照眼。其中，rhEGF治疗眼各组EGFR的表达在术后24h即出现高峰，一直持续到72h，其后表达逐渐降低;对照眼各组在术后24，48h EGFR的表达水平比较高，72h的表达就基本恢复正常水平。可见rhEGF可以更好的促进角膜EGFR的表达，这是EGF能够促进角膜修复的分子机制。另外，我们发现，烧灼30s之后的角膜形态发生了明显的变化，主要表现为角膜肿胀，全层结构疏松化，在冰冻切片中，角膜上皮层极易脱落，角膜基质层在固定过程中易脱水形成空洞。但rhEGF治疗眼组在术后72h角膜形态的这种变化就有了明显的好转，而对照眼组在术后120h，角膜各层的形态才基本恢复至正常水平。

　　我们仅对角膜上皮进行了表面烧灼处理，而没有进行其他损伤性的操作。rhEGF促进了这种损伤的修复，缩短了整个修复的进程。表现在通过对微绒毛形态的修复，加速上皮细胞的分裂和生长，从而加速角膜上皮的愈合，经调整和改善泪膜的分布进而起到治疗干眼症的作用。使用rhEGF在角膜上皮损伤后进行频繁点眼，可对损伤的角膜上皮起到促进修复的作用。因此，rhEGF可作为治疗眼表上皮细胞损伤，如角膜屈光手术、经眼表的各种内眼和斜视手术以及角膜上皮擦伤等而发生干眼症的一种新型药物在临床工作中广泛使用。

　　【参考文献】

　　1 Barabino S, Dana MR. Dry eye syndromes. Chem Immunol Allergy 2007;92:176184

　　2 Toda I. LASIK and dry eye. Compr Ophthalmol Update2007;8(2):7985

　　3 Labbe A，BrignoleBaudiuin F, Baudouin C. Ocular surface investigations in dry eye. J Fr Ophtalmol 2007;30(1):7697

　　4 Perry HD，Donnenfeld ED. Dry eye diagnosis and management in 2004. Curr Opin Ophthalmol2004;15(4):299304

　　5 Satici A, Guzey M, Dogan Z, et al. Relationship between Tear TNFalpha, TGFbeta1, and EGF levels and severity of conjunctival cicatrization in patients with inactive trachoma. Ophthalmic Res2003;35(6):301305

　　6 Chan KY, Lindquist TD, Edenfield MJ, et al. Pharmacokinetic study of recombinant human epidermal growth factor in the anterior eye. Invest

　　Ophthalmol Vis Sci1991;32(13):32093215

　　7张华，胡海涛，任惠明，等.家兔PRK术后角膜的组织病理、免疫组化及超微结构的实验研究.眼视光学杂志2000;2:9498

　　8王铮，李绍珍，陈家祺，等.准分子激光角膜切削术后角膜创面的愈合及皮质类固醇对愈合的影响.中华眼科杂志1996;32(4):172175

　　9 Fante FE, Hanna KD, Waring GO 3rd, et al. Wound healing after excimer laser keratomileusis(photorefractive keratectomy) in monkeys. ArchOphthalmol1990;108:665675

　　10 Fountain TR, Cruz Z, Green R. Reassembly of corneal epithelial adhesion structures after excimer laser keratectomy in humans. Arch Ophthalmol 1994;112:967972