基质细胞衍生因子1α对体外培养人视网膜色素上皮细胞增殖的影响研究

　　作者：徐国兴,陈瑾,郑学栋,郭健,谢茂松　　作者单位：350005)中国福建省福州市，福建医科大学附属第一医院眼科，福建省眼科研究所

　　【摘要】目的：研究基质细胞衍生因子1α(stromal cellderived factor1α，SDF1α)对体外培养的人类视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium，hRPE)细胞增殖的影响。方法：应用MTT法研究SDF1α对体外培养的人RPE细胞增殖的影响;用细胞化学染色法检测添加SDF1α前后人视网膜色素上皮细胞内细胞增殖核抗原(proliferating cell nucler antigen，PCNA)的表达情况。结果：MTT法表明SDF1α可促进体外培养的hRPE细胞的增殖(P<0.05);细胞化学电镜下观察发现：添加SDF1α前hRPE细胞未表达或低表达PCNA，而添加SDF1α后细胞高度表达PCNA。结论：细胞因子SDF 1α可促进体外培养的hRPE细胞增殖。

　　【关键词】 人视网膜色素上皮细胞 基质细胞衍生因子 1α 体外培养 增殖

　　Effect of stromal cellderived factor1α on the proliferation of human retinal pigment epithelium in vitro

　　GuoXing Xu,Jin Chen,XueDong Zheng,Jian Guo,MaoSong Xie

　　Foundation items: Science Research Foundation of Ministry of Health of the People’s Republic of China (No.WKJ20052013); Science Research Key Program of Fujian Province (No.002Y002); Professor Development Fund of Fujian Medical University (No.2006js6033)

　　Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University; Fujian Ophthalmic Institute, Fuzhou 350005, Fujian Province, China

　　Abstract

　　　AIM: To investigate the effect of stromal cellderived factor1α (SDF1α) on the proliferation of human retinal pigment epithelium (hRPE) in vitro.

　　 METHODS: MTT was used to investigate the effect of SDF1α on the proliferation of hRPE in vitro. Cytochemical staining method was used to detect the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in hRPE with SDF1α.

　　　RESULTS: MTT showed that SDF 1α could stimulate the proliferation of hRPE in vitro(P<0.05). Cytochemistry results indicated that there were no or low expression of PCNA before adding SDF1α, but the expression became higher after adding SDF1α observed under electric mirror.

　　　CONCLUSION: Cytokine SDF1α can stimulate the proliferation of hRPE cultured in vitro.

　　　KEYWORDS: human retinal pigment epithelium; stromal cellderived factor1α; culture in vitro; proliferation

　　0引言

　　随着炎症性眼病、白内障的控制和人类寿命的延长，由萎缩、变性和死亡导致的RPE细胞数量减少所致的功能障碍，已经成为很多视网膜疾病如年龄相关性黄斑变性及视网膜色素上皮变性等的原因[1]。寻找如何在体内抑制RPE细胞的丧失或维持RPE细胞功能的方法已成为治疗上述疾病的关键。近年来，视网膜色素上皮移植的兴起可望成为将来治疗这一类疾病的一种新技术[2]。体外传代培养是获取大量人类视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞进行研究和移植的首要条件。分析细胞因子促RPE细胞增殖效应，是体外获取大量的供体RPE来源的重要方法之一。这将为RPE细胞变性性疾病的移植治疗的前景提供新的证据。本文通过研究基质细胞衍生因子1α(stromal cellderived factor1α,SDF-1α)对体外培养的hRPE细胞生长及其DNA合成的促进作用，为进一步明确SDF1α的促RPE细胞增殖作用机制提供实验基础，为临床应用SDF1α治疗各种视网膜变性性疾病提供理论依据。

　　1材料和方法

　　1.1材料 hRPE细胞来源于角膜移植供体的健康成人眼球。DMEM/F12培养基、胎牛血清、小牛血清、2.5g/L胰蛋白酶均为Gibco公司产品，EDTA粉、PBS粉为Sigma公司产品，SDF1α为美国PEPROTECH公司产品，鼠抗人角蛋白质18抗体、鼠抗人PCNA单克隆抗体为美国ZYMED公司产品，二步法组化检测试剂盒(北京中杉金桥公司)。

　　1.2方法 hRPE细胞的取材(眼杯消化法[3])和培养：取角膜移植供体的健康成人眼球，用灭菌冰盒转移至超净工作台内，修剪球壁结缔组织，750mL/L酒精润洗眼球2次，用含500U/mL青霉素的PBS液冲洗干净，由角膜缘后3.5mm处环形剪开眼球壁，去除眼前节、玻璃体。将后段眼杯置于自制的眼球托上，不含血清的DMEM/F12培养液冲洗眼杯并用滴管反复吹打使眼球内壁表面菲薄的视网膜神经上皮层脱离，加入2.5g/L胰蛋白酶后放入培养箱中静置消化10min。取出吸除其中液体，再加入2.5g/L胰蛋白酶后放入培养箱中静置消化30min。取出后加含150mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液(完全培养液)终止胰蛋白酶反应，并用滴管吹打眼球内壁以使RPE细胞脱落分散。将含RPE细胞的液体移入离心管中，1000r/min离心10min，弃上清液。加入少许2.5g/L胰蛋白酶再次消化，吹打约5min后再加入完全培养液终止消化。再次离心弃上清液后加入完全培养液将RPE细胞悬浮并以2.0×105接种于25cm2培养瓶中，置于37℃、50mL/L CO2培养箱中培养。hRPE细胞的鉴定：角蛋白18免疫细胞化学染色鉴定采用标准化的SP法，取部分细胞进行细胞爬片，5d后取出盖玻片，在25℃室温下用PBS冲洗后40g/L多聚甲醛固定15min;PBS冲洗后加入10g/L TritonX100破膜20min;PBS冲洗后加入30mL/L H2O2灭活内源性过氧化物酶活性25min;PBS冲洗后加入羊血清封闭20min;加入一抗(鼠抗人角蛋白18单克隆抗体1:200稀释)37℃湿盒孵育80min;PBS冲洗后加入二抗(生物素标记的羊抗鼠IgG抗体)37℃湿盒孵育30min;加入链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶37℃湿盒孵育30min;PBS冲洗后直接DAB显色6min，苏木素复染，中性树胶封片。MTT法：检测不同浓度SDF1α对体外培养的hRPE细胞增殖活力的影响取第3～4代细胞，常规消化离心后，按每孔103～104个接种于96孔板，每孔200μL，培养24h后弃上清液，每孔加入200μL含有不同浓度SDF1α(0，25，50，75，100μg/L)的DMEM/F12培养基，每一浓度设3复孔，培养72h，每孔加入MTT 20μL，继续培养4h，弃去培养液，加入 DMSO 150μL震荡10min。酶联免疫检测仪测在490nm处的吸光度值OD。免疫细胞化学染色法检测添加SDF1α前后hRPE细胞内PCNA的表达情况：细胞爬片制作好后取出盖玻片，在细胞生长面做标记。PBS冲洗3min，3次，用40g/L甲醛固定10min。PBS冲洗3min，3次，甩干后滴加1滴表面活性剂Triton X100，室温下孵育20min以增加生物膜的通透性。滴加30mL/L H2O2封闭H2O2酶15min。PBS冲洗3min，3次，加入PCNA单克隆抗体孵育120min。PBS冲洗3min，3次，加入PCNA二抗孵育60min。PBS冲洗后直接DAB显色6min。苏木素复染，中性树胶封片。结果判断：本实验使用酶联免疫检测仪检测MTT的光密度值，采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对PCNA的表达进行半定量分析，每个标本随机选取5个不重叠的高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的光密度，以每个视野下5个视野光密度的平均值作为该例的测量值。

　　人视网膜色素上皮细胞的体外培养(P3)镜下观察(×100)

　　不同SDF1α浓度组的吸光度曲线(吸光度随着SDF1α浓度增高而增大，两者呈正相关

　　统计学处理：统计数据采用SPSS 11.0统计软件处理，以P<0.05作为差异有统计学意义的检验标准,P<0.01作为差异有显著统计学意义的检验标准。

　　2结果

　　2.1人视网膜色素上皮细胞的体外培养(P3)镜下观察 消化取材的hRPE原代细胞镜下为圆形，大小不一，胞体透亮，内含大量的色素颗粒，胞核无法辨认。当细胞贴壁后，细胞变扁平不规则的多角形，胞浆丰富，内可见黑色素颗粒，相对集中地分布于核的周围，核呈圆形或卵圆形，境界清晰，核仁明显，大小不一，数目不等，呈小圆形，细胞之间具有一定的联系。细胞贴壁后第3d增殖速度明显加快，至4～5d即可基本融合，细胞呈五角或六角形，细胞仍具有极性，色素偏向细胞一侧，与体内RPE细胞形态相似。细胞培养液内可见大量脱失的色素颗粒。细胞胞浆内色素颗粒则随传代次数增多而逐渐减少。

　 添加SDF1α前后hRPE细胞内PCNA的表达

　　A为阴性对照，B、C为正常对照组，D、E为实验组

　　2.2 MTT法 检测不同浓度SDF1α对体外培养的hRPE细胞增殖活力的影响：0,25，50，75，100μg/L组SDF1α的吸光度值分别为：0.11±0.05，0.22±0.05，0.4±0.8，0.6±0.9，0.8±0.9。差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.3免疫细胞化学染色法检测添加SDF1α前后hRPE细胞内PCNA的表达情况 PCNA抗原以细胞核内出现棕色颗粒为阳性反应，阴性对照组细胞核全部染成蓝色，胞浆和胞外均无棕黄色反应物。正常对照组可见部分细胞核呈棕色，PCNA阳性表达。实验组大量细胞核呈棕色或棕褐色，强阳性表达。镜下观察对PCNA的表达进行半定量分析，正常对照组和实验组的光密度分别为：0.184±0.015，0.120±0.009。两组图像的分析结果经t检验分析，组间差异有极显著统计学意义(P<0.01)。

　　3讨论

　　基质细胞衍生因子1是一种位于骨髓基质细胞mRNA 5 端点、平均400个碱基对的分泌型因子。1993年，Tashiro等[4]成功地克隆出SDFl，并提出其属于巨噬细胞内分泌型炎性蛋白超家族成员。有作者在研究中发现SDFl对淋巴细胞特别是淋巴前体细胞的生长分化具有重要作用，因此将其命名为前B细胞刺激因子(preB cell stimulatory factor，PBSF)，骨髓中前B细胞形成需要CXCR4，而胚胎期SDF1缺乏会损害胎肝前B细胞的发育。人类SDF1基因包括两种同分异构体：SDF1α和SDF1β。CXCR4为SDF1受体，高度保守，CXCR4广泛的表达在血液，免疫和中枢神经系统细胞上，有研究发现CXCR4是与HIV感染有关的一个重要因子[5，6]。研究表明SDF1/CXCR4生物学轴对肿瘤的影响是多方面的，在多种肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥重要作用。而且，趋化因子受体在信号转导中主要是通过耦联G蛋白发挥传递作用[7]。SDF1/CXCR4生物学轴在这一过程中发挥作用与MAPK以及AKT信号通路相关[8]。SDF1和CXCR4 广泛地表达于多种细胞和组织中，包括免疫细胞、脑、心脏、肾、肝、肺和脾，在免疫系统、循环系统及中枢神经系统的发育中起着至关重要的作用[9]。同时与HIV感染、炎症反应、造血细胞的调控作用、肿瘤细胞的迁移等密切相关。对CD34+细胞进行趋化活性试验发现，SDF1能引起造血干/祖细胞迁移率增加[10，11]。

　　增殖细胞核抗原PCNA又称周期素，其表达合成与增殖细胞的增殖周期有关，其量的变化与DNA合成一致[12]。PCNA是DNA合成及细胞周期顺利进行所必需的蛋白质之一，其具体的作用机制尚不清楚，可能作为DNA多聚酶的辅助蛋白质，协调DNA前导链和后随链的合成。

　　现已基本清楚健康RPE的移植有助于挽救感光细胞， 这表明试图通过移植健康的视网膜色素上皮细胞来恢复部分视功能，是一种有价值的探索。同种异体视网膜色素上皮细胞移植的动物研究已经取得一些进展，技术上也比较完善。但RPE细胞移植依然存在许多问题，如移植多少个细胞，原则上讲应该用健康的细胞代替那些变性坏死的细胞，并健康生长分化，与对应的细胞形成正常的连接。而供体来源即如何快速获得大量高纯度、高活力的视网膜色素上皮细胞是移植的关键之一。近年来许多学者致力于研究如何在体外促使RPE细胞高水平、持续表达。

　　4结论

　　本研究发现SDF1α可促进体外培养的hRPE细胞的增殖。在MTT试验中，随着SDF1α作用浓度的增加，吸光度也随之增高，亦即hRPE的增殖率增加，两者呈正相关。这提示在RPE移植中，SDF1α有可能促进hRPE高水平且持续的表达。而细胞组化观察发现：实验组大量细胞核呈棕色或棕褐色，强阳性表达，正常对照组仅部分细胞核呈棕色，细胞增殖核抗原少量阳性表达，实验组的PCNA表达明显高于对照组。这与MTT的结果是一致的，该结论说明SDF1α确能促进hRPE的持续高水平增殖。通过明确SDF1促RPE增殖的作用，将会有助于解决移植中RPE细胞数量来源的问题。本研究探讨细胞因子SDF1α对hRPE细胞增殖的影响，为探讨hRPE体外培养条件，为在hRPE移植中获取高水平、持续表达的供体RPE来源的进一步研究奠定实验基础。

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　　12 Hall PA, Levison DA, Woods AL, et al. Proliferating cell nuclear antigen(PCNA)immunolocalization in paraffin sections:An index of cell proliferation with evidence of deregulated expression in some neoplasms. J Pathol l990;162(4):285294