克拉霉素抑制角膜新生血管的实验研究

　　作者：黄祥平 作者单位：辽宁医学院附属第一医院眼科，辽宁 锦州 121001

　　【摘要】 目的 探讨克拉霉素对角膜新生血管形成及角膜内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ，VEGF) 表达的影响。方法 制备大鼠角膜碱烧伤新生血管模型，将42只SD大鼠随机分成正常组6只(6眼) 、胃饲克拉霉素60mg·kg-1的实验组18只(18眼) 、胃饲等量生理盐水的对照组18只(18眼)。运用裂隙灯、HE染色分别观察新生血管长度及面积、微血管的数量。结果 实验组新生血管生长速度变慢，血管面积减小，具有统计学差异(P<0.001) 。结论 一定剂量的克拉霉素可抑制角膜新生血管的发生。

　　【关键词】 克拉霉素 角膜新生血管 血管内皮生长因子 碱烧伤

　　Experimental Studies of Clarithromycins Inhibiting Corneal Neovascularization HUANG Xiang-ping，PANG Dong-bo

　　(Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University ,Jinzhou 121001 China)【Abstract】 Objective To study the inhibitive effects of clarithromycin on angiogenesis and expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF). Methods Alkali burns of corneal model was established as usual on 42 SD rats. The experimental rats were randomly divided into control group and study group, and another 6 SD rats worked in normal group. The occurrence and development of corneal neovascularization (CRNV) were observed by thslit-lamp microscopy. Results In the experiment group, CRNV grew more slowly. The area of blood vessel became smaller, which had a statistical difference. Conclusions Acertain dosage of clarithromycin can inhibit the occurrence of CRNV.

　　【Key words】 clarithromycin;corneal neovascularization; vascular endothelial growth factor; alkcaline burn

　　角膜没有血管,其营养成分由角膜缘血管网扩散入角膜。在病理状态下,从角膜缘血管网形成的新生毛细血管逐渐侵入角膜而形成角膜新生血管(corneal neovascularization, CRNV) ,是一种常见的眼部病变。它可引起角膜正常微环境的破坏,使眼前节段相关的免疫赦免偏离消失，是角膜移植术后发生排斥反应的高危因素[1] 。克拉霉素(clarithromycin,CAM)是临床上广为应用的新型14 环大环内酯类抗生素,由于CAM 参与调控许多与血管生成密切相关的细胞因子,因此CAM 可能是一种潜在的血管生成抑制剂。本实验建立大鼠角膜碱烧伤模型，同时加入CAM干预，通过免疫组化等方法观察伤后不同时期VEGF表达情况及新生血管的演变过程，以揭示VEGF与角膜新生血管之间的时空关系，并对CAM抑制CRNV发生的机制做初步探讨。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物 健康SD大鼠42只，体重200～300g，雌雄不拘，由辽宁医学院实验动物中心提供。术前经裂隙灯检查均无明显眼前段病变，任选6只作为正常组，其余36只建立角膜碱烧伤模型后随机分成对照组和实验组，每组18只18眼。

　　1.1.2 模型制备 36只(36 眼) SD大鼠，10%水合氯醛(2mL·kg-1) 腹腔注射麻醉，滤纸条吸干结膜囊液体后，将统一规格直径3mm的滤纸片，浸泡在1mol·L-1 NaOH 溶液中，达饱和状态，置于干燥滤纸上1秒蘸去多余的碱液，放于右角膜中央40s，立即用60mL生理盐水冲洗角膜及结膜囊，常规喂养。

　　1.1.3 给药方法 采用克拉霉素片(每片125mg，购自黑龙江肇东华富药业有限责任公司)用生理盐水配制成浓度为4g·L-1的新鲜溶液。实验组 克拉霉素溶液15mL·kg-1(60mg·kg-1)胃饲，每日1次;对照组生理盐水15mL·kg-1胃饲，每日1次;正常组常规喂养。

　　1.2 观察方法

　　1.2.1 角膜新生血管的观察 于造模后1d开始每日用裂隙灯观察角膜新生血管的发生情况，至各组均出现角膜新生血管后改为隔日观察。

　　1.2.2 角膜新生血管面积的测量：于造模后4、7、14d随机选取实验组、对照组各6只动物测量新生血管的面积，按Robert电脑数学模型公式A=C/12×3.1416[r2-(r-l)2]计算。A为角膜新生血管生长面积，C为角膜新生血管累及角膜的圆周点数，l为角膜新生血管从角膜缘深入角膜的长度，r为角膜半径。

　　1.2.3 病理形态学 测量新生血管后的动物和正常组的动物处死，取下角膜，生理盐水冲洗干净，置于4%多聚甲醛中保存固定24h，行HE染色，观察角膜形态学变化。同时取14d的HE染色切片计数微血管数量，每张切片选择4个视野(×400倍) ，计数微血管数量(支/视野) ，取其平均值。

　　1.3 数据处理

　　角膜新生血管长度、面积均用均数±标准差(±s)表示，用SPSS12.0数据包行独立样本t检验分析。病理形态学及免疫组化资料采用对比描述分析。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠角膜碱烧伤后裂隙灯观察的情况

　　对照组：第一天角膜上皮水肿，角巩膜缘血管扩张充血;第四天角巩膜缘处有新生血管芽呈刷状生长，并逐渐向角膜中央生长;第七天角膜新生血管生长最为旺盛，显著变长，粗大;14d时新生血管交织成网状，几乎布满整个角膜。实验组：在各时间点上较模型组血管均细小，短而稀疏，多集中于角膜缘，生长缓慢且未交织成网状。

　　2.2 角膜碱烧伤后角膜新生血管长度、面积

　　在各时间点上，对照组角膜新生血管的长度、面积与实验组比较(表1)，均有统计学差异，P<0.001。 表1 角膜新生血管的长度、面积

　　2.3 显微镜下血管形态观察

　　对照组：碱烧伤后4d角膜缘处新生血管数量较多，呈扩张状态; 7 d角膜浅基质层内已可见较多新生血管; 14 d角膜基质层内可见大量成熟新生血管，管腔内有成熟红细胞，管腔粗大(图2)。实验组：碱烧伤后4d角膜缘处少量毛细血管扩张; 7 d角膜缘处可见正在生长的血管芽，未见成熟血管; 14 d角膜浅基质层内可见新生血管，管径较小，分布较稀疏(图1)。

　　2.4 计数微血管数量的结果

　　在造模后14 d时，对照组角膜的微血管数量为8.61±2.36，实验组为3.52 ±1.67，两者比较t值为7.874 ，P<0.001，有统计学差异。

　　3 讨 论

　　角膜新生血管是与角膜化学性烧伤、角膜炎症及角膜移植排斥反应密切相关的常见病理现象，发生机制复杂，多种细胞因子均参与角膜新生血管形成，VEGF是目前发现的最重要的血管生长因子，为新生血管增殖效应的启动因子之一。Amano等[2]发现在鼠CRNV模型中,伴随着角膜受伤后的炎症和新生血管的出现,VEGFmRNA和蛋白水平明显增高,且VEGF中和抗体有效的抑制了CRNV的形成。Lai等[3]实验证明特异性的下调VEGF的产生可以明显的减少角膜新生血管的发生。

　　克拉霉素是新型大环内酯类抗生素，大量研究发现CAM对肿瘤诱发的血管生成有明显的抑制作用。柏长青等[4]在对人小细胞肺癌的研究中发现克拉霉素能够明显抑制人肺癌细胞表达VEGF 和MMP-9。Yatsunami 等[5] 的研究表明,克拉霉素为肿瘤血管生成因子的强大抑制剂。利用小鼠背侧肺泡活体模型，研究了克拉霉素对肿瘤诱发血管生成的抑制作用，血药浓度≥10mmol·L-1 便能抑制内皮细胞管样化的形成。Matsune等[6]的研究表明，CAM能够抑制鼻息肉中成纤维细胞表达VEGF。本研究我们应用颜世龙等[7]介绍的大鼠角膜新生血管模型，观察了CAM胃饲对CRNV的影响，研究结果显示CAM对碱烧伤引起的CRNV 有明显的抑制作用，主要表现在CRNV 出现的时间延迟， CRNV 生长面积和最长CRNV 生长长度的减少，以及微血管数量的减少，对照组和实验组间有统计学差异。实验提示CAM在抑制CRNV生成中有潜在的应用价值。但CAM的抗血管生成作用机制及实验临床应用等还需要进一步的研究。(此文图1-2见附页2)

　　【参考文献】

　　[1] 谢立信，史伟云，董晓光，等. 高危角膜移植围手术期治疗[J] .眼科新进展(Yanke Xinjinzhan)，2000，20 (3) ：196-198.

　　[2] Amano S, Rohan R, Kuroki M,et al. Requirement for vascular endothelial growth factor in wound-and inflammation-related corneal neovascularization [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1998，39(1):18-22.

　　[3] Lai CM, Spilsbury K, Brankov M,et al. Inhibition of corneal neovascularization by recombinant adenovirus mediated antisense VEGFRNA[J] . Exp Eye Res，2002，75(6)：625-634.

　　[4] 柏长青，刘伟，戚好文，等.克拉霉素对肺癌细胞VEGF 、MMP-9 表达的影响[J] .西安医科大学学报，2002，23(3)：223-226.

　　[5] Yatsunami J , Turuta N , Wakamatsu K ,et al.Chlarithromycin is a potent inhibitor of tumor-induced angiogenesis [J ] . Res Exp Med，1997，197 (1) ：189 -197.

　　[6] Matsune S，Sun D，Ohori J，et al. Inhibition of Vascular Endothelial Growth Factor by Macrolides in Cultured Fibroblasts from Nasal Polyps[J] . Laryngoscope ，2005，115(11)：1953-1956.

　　[7] 颜世龙，梁丹，林妙丽，等. 碱烧伤大鼠角膜新生血管模型的初步探索[J] . 眼科学报，2005，21：165-169.