LAMA1基因与单纯性高度近视的相关性研究

作者：张丰菊作者单位：大连医科大学附属第一医院 眼科，辽宁 大连 116011；    【摘要】  目的 分析单纯性高度近视眼及非近视眼巩膜组织中的LAMA1基因在转录水平（mRNA水平）是否存在显著性差异，探讨其与病理性近视的相关性。方法 收集8例行抗青光眼手术的原发性开角性青光眼患者（伴有单纯性高度近视）、5例自愿捐献角膜的健康正常人（正视眼）及5例行抗青光眼手术的原发性开角性青光眼患者（不伴有单纯性高度近视）术中切除的眼前节巩膜组织。提取所收集的巩膜组织中总RNA，针对LAMA1基因设计特异性引物进行RT-PCR检查（reverse transcription-polymerase chain reaction），用凝胶分析系统测定各样本β-actin和LAMA1基因PCR反应产物电泳条带灰度值，以β-actin电泳条带为参照，求出各样本LAMA1基因PCR反应产物电泳条带灰度值和β-actin电泳条带灰度值的比值(LAMA1/β-actin)，继而对所得比值采用单因素方差分析(one-way ANOVA)等统计学方法进行统计分析。结果 各样本LAMA1基因PCR反应产物电泳条带灰度值和β-actin电泳条带灰度值的比值(LAMA1/β-actin)，在正常对照组[(1048.36±31.75)×10-4]和青光眼组[(1058.29±45.62)×10-4]之间比较差异无显著性(P>0.05)，而在单纯性高度近视组[(20.50±21.74)×10-4]明显低于非近视组（正常对照组和青光眼组），两组差异有显著性(P<0.01)。结论 病理性近视候选基因的LAMA1基因，在单纯性高度近视眼的巩膜组织中其转录水平明显降低，初步判定LAMA1基因与病理性近视具有相关性。但其在转录水平受抑制的机制及如何导致病理性近视的形成有待进一步研究。

【关键词】  LAMA1基因 单纯性高度近视 逆转录聚合酶链反应

    病理性近视(pathological myopia，PM)又称恶性近视或高度近视，可伴有弱视、青光眼、白内障、玻璃体混浊、视网膜脱离等多种并发症，是导致低视力及盲的遗传性眼病之一。病理性近视占近视人群的27%～33%，有明显的遗传倾向，存在种族差异。黄种人患病率高，白种人患病率较低[1]。病理性近视在病因学上有明显的遗传因素，而在我国病理性近视的遗传具有更强的遗传异质性[2]，因此，对病理性近视进行病因学研究，探讨其发病机制，以期从根本上对其进行防治就显得意义重大。

    至今已肯定的高度近视基因位点有9个，包括MYP1（Xq28）、MYP2（18p11. 31）、MYP3（12q21-q23）、MYP4（7q36）、MYP5（17q21-q22）、MYP11（4q22-q27）、2q37.1、Xq23-q25和15q12-13[3-5]。其中位于MYP2（18p11.31）的LAMA1基因被认定为可能与高度近视有关的候选基因， 因为它编码层黏连蛋白（laminin，LN）的?琢1链，而层黏连蛋白与病理性近视机制密切相关[6]。Lam等[7]发现中国人病理性近视家系的致病基因主要位于18p11.3，因此，对MYP2的研究成为近年来国内外研究的热点，故本研究选取位于MYP2（18p11.31）的LAMA1基因进行探讨。

    1  对象和方法

    1.1  实验对象  2004~2006年在大连医科大学附属第一医院住院行抗青光眼手术的原发性开角性青光眼（primary open-angle glaucoma，POAG）患者（伴与不伴有单纯性高度近视）及自愿捐献角膜的正常人。各组分组兼顾年龄、地区及种族差异[8-9]，均选择：?譹?訛年龄为18~45岁。?譺?訛籍贯为东北地区。?譻?訛汉族人群。

    1.1.1  单纯性高度近视组  8例8眼(男5眼，女   3眼)，入选标准：①电脑验光仪测屈光度：-6.5～    -12.5 D（平均为-9.0 D）。②A型超声测量仪测眼轴：27.16～29.20 mm（平均为27.98 mm）。③年龄：32～40岁（平均35.2岁）。④眼底改变：后极部视网膜、脉络膜大片萎缩灶和后巩膜葡萄肿等。⑤排除病理性近视相关全身疾病[10-15]：如Stickler综合征、Marfan综合征及自身免疫性疾病等。⑥患者均知情同意并签定患者知情同意书。

 1.1.2  非病理性近视组  (1)角膜移植供眼组（正常对照组）：5例5眼(男5眼)，取自自愿捐献角膜的健康成年人，并具备：①年龄，19～35岁（平均为24.8岁）。②眼球摘除后尽快行视网膜带状检影屈光度（以下均为等值球镜SE）为+0.75～-1.25 DS。③眼球摘除后尽快用A型超声测量仪测眼轴，23.96～24.50 mm（平均24.16 mm）。④无家族遗传病史及自身免疫病史。(2)青光眼组：5例5眼(男2眼，女3眼)，并具备：①屈光度，+1.0～-2.25 DS。②年龄，31～45岁（平均为37.8岁）。③眼轴长度，23.54～24.86 mm。④不伴病理性近视眼底改变并排除以上相关全身疾病。⑤患者均知情同意并签定患者知情同意书。

    1.2  实验方法

    1．2．1  标本的采集与保存  小梁切除手术中取各组新鲜内层巩膜组织，置Ep管中，蜡膜封口，液氮快速冷冻后于-80℃冰箱中保存。取材及保存过程中所用材料、器皿均经DEPC处理（包括0.1% DEPC溶液浸泡过夜，蒸馏水冲洗及高压灭菌15 min以去除残存的DEPC）。各组取材均为同一术者采用同一种术式所取，且取样前均未使用抗代谢药。

    1.2．2  RNA提取  因巩膜组织为纤维结缔组织，细胞成分较少且所取组织量较小，采用常规粉碎方法无法进行粉碎，故应用反复冻融法破坏细胞，从而充分释放RNA。

    1.2.3  琼脂糖凝胶电泳检测  各样本均成功提取RNA，且纯度均较高。

    1.2.4  紫外分光光度计测定RNA含量（OD值μg/μl）

    1.2.5  逆转录反应（RT反应） 根据上述OD值，各样本以病理性近视组3号样本为基数进行稀释。在Ep管中加入反应液，按以下条件进行反转录反应：55℃ 30 min/99℃ 5 min/5℃ 5 min。

    1.2.6  PCR反应  ?譹?訛β-actin：于新Ep管中加入反应液，混匀后放入PCR仪中，按以下条件进行反转录反应进行扩增。琼脂糖凝胶电泳检测：电泳使用1%琼脂糖凝胶，电流为30 mA，电泳时间为30 min。?譺?訛LAMA1基因：于新Ep管中加入下列反应液，PCR 引物上游引物序列为：5'-GATGACAACAGATGGCACAGT-3'，下游引物序列为：5'-ACTGGTGTTATAGGCATCGAT-3'（引物由中国大连TaKaRa生物工程有限公司合成）。混匀后，放入PCR仪中，按条件进行反转录反应进行扩增。琼脂糖凝胶电泳检测：电泳使用1%琼脂糖凝胶，电流为30 mA，电泳时间为30 min。

    1.2.7  凝胶成像系统分析各组β-actin和LAMA1基因PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳所得条带。

    1.2.8  统计学方法  各样本LAMA1基因PCR反应产物电泳条带的灰度值分别与其相对应的β-actin电泳条带的灰度值相比，所得数值采用方差分析的方法以SPSS11.5统计软件进行分析。所得比值(LAMA1/β-actin)应用单因素方差分析(one-way ANOVA)及方差分析中均数的两两比较结果显示三组之间差异是否有显著性。

    2  结果

    2.1  RT-PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳检测结果

    2.1.1  单纯性高度近视组的β-actin和LAMA1基因检测结果见图1和图2。电泳检测结果提示，近视组的8个样本的LAMA1基因灰度均低于其各自的对照组。

    2.1.2  非病理性近视组（正常对照组及青光眼组）的β-actin和LAMA1基因检测结果见图3、图4。电泳检测结果提示，与其各自的对照组相比，非病理性近视组10个样本的LAMA1基因灰度均无明显变化。

    2.2  凝胶成像系统分析各组β-actin和LAMA1基因  PCR反应产物电泳条带灰度值(IOD)及各样本LAMA1基因PCR反应产物电泳条带灰度值和β-actin电泳条带灰度值相比所得比值(LAMA1/β-actin)见表1。由表1可见：各样本LAMA1/β-actin比值在单纯性高度近视组明显低于青光眼组，差异极显著（P=0.000＜0.01)；同时与正常对照组相比也明显降低，差异极显著（P=0.000＜0.01)；正常对照组和青光眼组各样本LAMA1/   β-actin相比差异无显著性（P=0.634＞0.05）。

 3  讨论

    病理性近视发病机制目前尚不完全清楚。电镜证实病理性近视所出现的眼轴加长和眼底改变与巩膜自身结构变化有关[6-8]。许多研究都肯定了高度近视的遗传性。

    3．1  病理性近视的巩膜组织的特点  Curtin等[14]和Liu等[15]用电镜检查了正常人的巩膜和高度近视眼的巩膜，发现两者的主要区别在于胶原束结构、纤维直径分布和纤维形态三方面的改变。近视眼巩膜结构的变化，主要是胶原纤维进行性破坏[16]。本研究由于难以取得眼球后部巩膜组织，所以只能行前部巩膜组织的比较分析以期为临床合理治疗提供依据。

    实验性近视动物模型眼的病理研究发现：近视鸡眼巩膜软骨层增厚，细胞密度降低，纤维变薄，纤维呈板层状排列。Gottlieb等[16]认为近视眼巩膜板层结构呈非正常交织结构，降低了巩膜抗扩张能力。另有研究发现，无论高度近视人眼或动物眼都表现巩膜胶原积聚减少，巩膜变薄，组织丢失，胶原纤维直径变小，这对巩膜生物力学的变化给予了解释[14-17]。

    3．2  层黏连蛋白及其与病理性近视的关系  层黏连蛋白[17](laminin LN)，是胚胎发生时期产生最早的蛋白分子之一，是一种重要的细胞外基质，它起到将巩膜层内及各层间胶原纤维和微纤维连结起来的作用，对维持巩膜的组织结构和功能起到重要作用。巩膜组织中层黏连蛋白合成减少、降解增加或在细胞及巩膜组织中的分布异常均可导致巩膜结构及韧性改变，在眼内压的作用下可导致眼轴加长、巩膜壁变薄等，这些变化可能参与病理性近视的形成过程。因此，研究病理性近视眼巩膜组织中层黏连蛋白的表达量及其细胞和组织分布，对于深入了解病理性近视的形成机制有重要意义。层黏连蛋白的这些特征使得LAMA1基因成为最具吸引力的后选基因。

    3．3  原发性开角性青光眼（POAG）与病理性近视的关系  通常认为PM与POAG密切相关[9]。据统计，病理性近视人群的平均眼内压（IOP）比正常人群升高27.8%。POAG、高眼压症通常伴有病理性近视，因此POAG人群病理性近视的发病率较高。20世纪早期，Silling 和 Elshing 指出病理性近视实际上是一种进展较慢、较隐匿的POAG，两者可能被同一等位基因的不同表现型所控制。

    本研究结果提示：LAMA1基因在单纯性高度近视眼的巩膜组织中转录水平较单纯开角型青光眼和正常对照组显著降低(P<0.01)，但在正常对照组和青光眼组差异无显著性(P>0.05)，初步说明LAMA1基因可能仅参与病理性近视的形成，而与POAG无关。但因本实验样本例数较少，故LAMA1基因与POAG的相关性尚需进一步研究。

    3．4  LAMA1基因及其与病理性近视的关系   LAMA1基因定位于18p11，位于高度近视基因位点MYP2（18p11.31）的区域内，全长9530 bp，可在全身大多数组织中表达，编码LN α1链[17]。因层黏连蛋白的α1链在维系LN结构和功能上起主要作用，故若LAMA1基因发生突变或表达异常都将对层黏连蛋白的合成、分布、结构和功能有着重要的影响。

    本研究表明：被认定为病理性近视候选基因的LAMA1基因，在单纯性高度近视眼的前部巩膜组织中其转录水平较非病理性近视对照组显著降低(P<0.01)，进而导致层黏连蛋白合成减少，巩膜结构及韧性改变，眼轴加长、巩膜壁变薄等，参与病理性近视的形成过程，因此，初步判定LAMA1基因与病理性近视具有明显的相关性。但其在转录水平受抑制的机制及如何导致病理性近视的形成乃至LAMA1基因是否是病理性近视的致病基因有待进一步研究。

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