配戴软性角膜接触镜者ICAM1和HLADR表达的改变

作者：赵茂竹,郑洋,乔一平    作者单位：1（610110）中国四川省成都市，四川省人民医院城东病区眼科；2（646000）中国四川省泸州市，泸州医学院附属医院眼科 　　【摘要】  目的：观察正常人和配戴软性角膜接触镜（soft contact lens, SCL）人群结膜上皮细胞表面亚临床炎症因子HLADR和细胞内黏性分子1型ICAM1（CD54）的表达改变法：采用结膜印迹细胞学（conjunctival impression cytology,CIC）收集结膜上皮细胞，流式细胞学检查方法测定正常人及配戴软性角膜接触镜者HLADR和CD54的表达水平,计算阳性细胞率。结果：长期配戴软性角膜接触镜（＞5a）组及（＜5a）组中ICAM1和HLADR的表达较正常人组相比明显增加(PHLADR1＜ 0.01, PICAM1,1＜0.01;PHLADR2＜0.01,PICAM1,2＜0.01),，前二者比较CD54有明显变化（P＜0.01）而HLADR无明显变化（P＞0.05）。结论:长期配戴软性角膜接触镜者结膜亚临床炎症因子ICAM1和HLADR明显增加，眼表的亚临床炎症增加。

　　【关键词】  印迹细胞学;软性角膜接触镜;ICAM1;HLADR;眼表组织

　　Changes of ICAM1 and HLADR induced by longterm soft contact lens wearMaoZhu Zhao , Yang Zheng, YiPing QiaoFoundation item: Key Fund Project of Sichuan Provincial Education Department (No.329) 1East Ward Eye Department, Sichuan Provincal Peoples Hospital, Chengdu 610110, Sichuan Province, China; 2Department of Ophthalmology,Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000,  Sichuan Province, ChinaAbstractAIM: To observe the change of inflammation agent production of the conjunctiva HLADR and intercellular adhesion molecule type 1 (ICAM1) (CD54) in normal subjects and in soft contact lens (SCL) wear subjects. METHODS: Conjunctival impression cytology(CIC) were used to collect conjunctival epithelium, and the expression levels of HLADR and CD54 in normal subjects and in SCL wear subjects were determined by flow cytometry. The percentage of positive cells was calculated and compared between each group. RESULTS: A significant increase of inflammation markers (HLADR and ICAM1) was observed in the longterm（＞5a） and shortterm（＜5a） SCL group compared with the control group (PHLADR1＜0.01,PICAM1,1＜0.01;PHLADR2＜0.01,PICAM1,2＜0.01). For the two SCL groups, ICAM1 has significant change(P＜0.01), but HLADR has no significant change(P＞0.05 ).CONCLUSION: This study confirms the difference in expression of inflammation markers (HLADR and ICAM1) in SCL and the healthy adult. It demonstrates a significant increase of subclinical conjunctival inflammation in SCL compared with the normal.　　KEYWORDS: conjunctival impression cytology; soft contact lens; ICAM1; HLADR; ocular surface0引言    　　配戴软性角膜接触镜会引起急性和慢性临床并发症（如角膜溃疡，巨乳头状结膜炎或角膜新生血管等的形成）。角膜接触镜作为表面异物可能会导致眼表的亚临床改变,Pisella等[1]报道，配戴角膜接触镜会引起结膜的亚临床炎症。结膜上皮细胞的亚临床炎症通常是一种慢性侵蚀的过程，这种病变属于眼表的慢性改变，比如干眼症,巨乳头状结膜炎等。我们采用结膜印迹细胞学（conjunctival impression cytology,CIC），通过流式细胞学方法检测结膜上皮表达HLADR和ICAM1的变化，评估眼表炎症反应及配戴软性角膜接触镜人群中结膜的可能改变，探讨长期配戴软性角膜接触镜与眼表亚临床炎症的相关性。

　　1对象和方法

　　1.1对象

　　对200704/200804进行LASIK术前检查，年龄18～40岁之间健康成年人，男女比例随机。其中正常对照组26例，男14例，女12例，年龄18～25（平均19.0）岁；配戴SCL 1d～4a，平均1a者32例，男18例，女14例，年龄18～25（平均19.5）岁；配戴5.5～14a，平均6a者27例，男7例，女20例，年龄21～39（平均25）岁。受试者均身体健康，无吸烟史，无长期操作电脑史，近2wk内未滴任何眼液并经检查排除实质性角结膜干燥症和Sjgren综合征及由其他原因引起的眼部疾病。

　　1.2方法

　　醋酸纤维膜8cm×10cm(浙江台州四青塑料厂)；HLA DRPEmAb、CD54FITCmAb，Mouse IgG1FITC，IgG1PE mAb（阴性对照）来自于Beckman Coulter 公司；EpicsXL型号流式细胞仪来自Beckman Coulter 公司。醋酸纤维膜剪成5mm×7mm大小，环氧乙烷消毒备用。取材时用眼科无齿镊夹持纤维膜，将粗糙面置于受试者颞侧球结膜表面，玻璃棒轻压约10s取出，将滤纸条含1g/L甲醛PBS液的试管中（PH 7.2～7.4）。采集样本后放置于快速旋涡混匀器上处理30min，尽可能将细胞从纤维膜上洗涤入1g/L甲醛PBS液中变为悬浮细胞；样本3000转/min离心5min，去上清； 每管样本分别加入HLA DRPEmAb，CD54FITCmAb各20μL，阴性对照组加Mouse IgG1FITC，IgG1PEmAb各20μL，室温避光孵育20min；每管加入PBS液500μL，上流式细胞仪，分析阳性细胞百分率。以细胞膜上表达CD54 和HLADR抗体为阳性细胞：CD54阳性细胞%= CD54阳性细胞数÷（CD54阳性细胞数+CD54阴性细胞数）×100%－非特异性结合细胞数；HLADR阳性细胞%= HLADR阳性细胞数÷（HLADR阳性细胞数+HLADR阴性细胞数）×100%－非特异性结合细胞数；    　　统计学分析：采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，对流式细胞学数据检测3组间比较采用KruskalWallis Test方法，各组之间CD54和HLADR 之间的比较采用MannWhitney方法，相关性采用 Test Spearman 相关分析。检验水准P＜0.05。

　　2结果    　　正常对照组CD54阳性细胞率为0.54%～27.4%，平均4.53％（P25～P75为2.39％～7.57％），HLADR阳性细胞率0.56%～28.4%，平均3.99％（P25～P75为2.63％～6.07％）；配戴SCL＜5a组，CD54阳性细胞率4.28%～48.8%，平均9.98％（P25～P75为8.04％～17.65％），HLADR阳性细胞率3.32%～43.0%，平均7.86％（P25～P75为5.53％～16.03％）；配戴SCL＞5a 组CD54阳性细胞率3.22%～71.2%，平均20.10％（P25～ P75为12.70％～25.70％），HLADR阳性细胞率3.25%～69.6%，平均11.70％（P25～ P75为8.07％～20.20％）。表13各组P值比较。由表1可见CD54三组间的比较不符合参数分布，用非参数的统计分析方法分析每两组间CD54表达有统计学差异（P＜0.01)。表2可见HLADR三组间的比较也不符合参数分布，用非参数的统计分析方法，HLADR的表达正常组和另外两个组分别有统计学差异（P＜0.01)，但两个配戴组间没有统计学差异。表2可见各组之间CD54和HLADR 之间阳性细胞率成正相关关系。表1CD54各组间P值比较（略）表2HLADR各组间P值比较（略）表3各组之间CD54和HLADR 之间阳性细胞率的相关性（略）   　　经KruskalWallis Test分析，CD54指标 χ2＝36.049，df＝2，P=0.00015＜0.01；HLADR指标χ2＝23.115，df＝2，P=0.00096＜0.01。做两两比较，用MannWhitney统计分析：CD54正常组和配戴＜5a组：P=0.00024＜0.01，正常组和配戴＞5a组：P＝0.00017＜0.01，配戴＜5a组和配戴＞5a组：P＝0.00101＜0.01。可见：每两组间CD54表达有统计学差异。HLADR正常组和配戴＜5a组：P=0.00087＜0.01，正常组和配戴＞5a组：P＝0.00020＜0.01，配戴＜5a组和配戴＞5a组：P＝0.183 ＞0.05。可见：HLADR的表达正常组和配戴SCL的2组分别有统计学差异，但2个配戴组间没有统计学差异。经Spearmann相关分析，CD54和HLADR阳性细胞率相关性：正常P=0.007﹤0.01。可见：各组之间CD54和HLADR 之间阳性细胞率成正相关关系。

　　3讨论   　　流式细胞学和印迹细胞学方法结合，是一种简单、无创、方便快捷的观察细胞数量及衡量结膜上皮细胞炎症的可靠方法[2]。流式细胞学将细胞悬浮于PBS液里（PH 7.2～7.4）中,采用流式细胞学检查不会丢失细胞数量,对细胞的损害减至最低，并可以一次性检测到大量细胞。HLADR 为MHCII类分子,是成熟DC(树突状细胞)表面高表达的一类重要分子，是DC抗原呈递的物质基础。CD54亦称细胞间黏附分子1(ICAM1),是免疫球蛋白超家族成员之一,为单链跨膜糖蛋白。其生物学作用主要是与其配体结合介导白细胞与血管内皮细胞的黏附,促进炎症的发生与发展。这是机体许多重要的生理和病理过程所必不可少的步骤。Baudouin等[3] 证明了在正常人的结膜上皮细胞少量或者不表达HLADR以及CD54。有研究证明，在Sjogren综合征患者的结膜上皮细胞表达HLADR 和CD54较正常人表达明显增加[4]。在患有中等到严重干眼症的患者中，Brigno等[5]发现眼表结膜上皮细胞HLADR的表达水平明显增高，几乎所有眼睛都表达高水平的HLADR阳性上皮细胞。以前报道用相似的流式细胞学方法测量印迹细胞[6]和细胞刮片的结论与这些结论是相同的。Ⅱ类抗原HLADR是免疫活性细胞表达的膜抗原，通常受到抗原呈递细胞的限制,炎症反应会引起上皮细胞HLADR表达。也有报道称慢性结膜炎和干眼症的结膜细胞中HLADR会过量表达[7]。    　　我们的研究证明，在配戴角膜接触镜人群中亚临床炎症因子HLADR和CD54的表达较正常人群明显增加，这证明了角膜接触镜作为表面异物会导致眼表的亚临床炎症。结膜上皮细胞的亚临床炎症通常是一种慢性侵蚀的过程，这种病变属于眼表的慢性改变。日常配戴接触镜，特别是软性接触镜会增加眼表炎症和感染的风险。CD54在每个组之间都有显著变化，这说明了随着配戴时间的增加，可能细胞间黏附作用越来越紧密，这也进一步说明了随着配戴时间的增加，出现炎症的风险增加。然而HLADR在配戴＜5a组和配戴＞5a组之间无明显变化，我们考虑这可能和配戴SCL后患者出现了耐受有一定关系。我们的研究也证明了CD54和HLADR阳性细胞率的表达成正相关关系，这也说明了二者之间具有协同的关系。二者相互作用，可以进一步增加炎症出现的可能性，也增加了配戴SCL出现感染的几率。配戴软性角膜接触镜患者，不管其配戴时间长短，都会对CD54和HLADR的表达产生影响，这也间接与接触镜配戴引起的亚临床炎症有一定关联。然而SCL的配戴是否会对眼表其他组织成分产生影响，还需要我们进一步的研究。我们认为，有必要对配戴软性角膜接触镜患者的结膜上皮细胞状况进行深入研究，为临床更好的诊治接触镜配戴引起的亚临床炎症及感染提供理论依据。

【参考文献】　　1 Pisella PJ, Malet F, Lejeune S, et al. Ocular surface changes induced by contact lens wear. Cornea 2001;20:820825

　　2 Pisella PJ, Brignole F,Debbasch C, et al. Flowcytometric analysis of Conjunctival epithelium in ocular rosacea and kerato conjunctivitis sicca. Ophthalmology 2000;107:18411849

　　3 Baudouin C, Brignole F, Pisella PJ, et al. Immunophenotyping of human dendriform cells from the conjunctival epithelium. Current Eye Rresearch 1997;9:475481

　　4 Tsubota K, Fujihara T, Saito K, et al. Conjunctival epithelium expression of HLADR in Dry eye patients. Ophthalmologica 1999;213:1619

　　5 Brignole FC, Pisella PJ, Goldschild M, et al. Flow cytometric analysis of inflammatory markers in conjunctival epithelial cells of patients with dry eyes. Invest Ophthalmol Vis Sic 2000;41:13561362

　　6 Brignole FC, SaintJean M, Goldschild M. Expression of FasFas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium:positive correlation with class II HLADR expression in inflammatory ocular surface disorders. Exp Eye Res 1998;67:687697

　　7 Tsubota K, Fukagawa K, Fujihara T, et al. Regulation of human leukocyte antigen expression in human conjunctival epithelium. Invest