巨噬细胞炎性蛋白-2在病毒性心肌炎小鼠中的表达及黄芪的干预作用

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是临床常见的心血管系统疾病之一，近年来在成人和青少年中的发病率呈逐年上升趋势，严重危害人类生命健康。大量的炎症细胞在心肌浸润构成VMC特征性的病理改变，而炎症细胞的浸润是细胞与细胞、细胞与分子之间相互作用的结果，是一多因素参与、多步骤的复杂过程。目前已证实趋化因子在其中起着关键的作用。巨噬细胞炎性蛋白-2（monocyte chemoattractant protein-1， MCP-1）是趋化因子CXC家族成员之一，可特异性趋化中性粒细胞和淋巴细胞到炎症部位，在慢性支气管炎、肝炎等多种炎症性疾病的发生发展中起重要作用[1,2]。然而MIP是否参与VMC发病过程国内未见报道。黄芪作为临床治疗心肌炎与心力衰竭的主要药物，近来一项多中心临床研究表明，黄芪注射液对VMC有良好的治疗作用[3]，但其作用机理尚未完全阐明。本研究通过观察MIP-2在VMC小鼠心肌组织中的表达，并以黄芪进行干预治疗，旨在探讨MIP-2在VMC发病机制中的作用及黄芪的干预效果。1　资料与方法1.1病毒、药品及主要试剂柯萨奇病毒B3（coxsackievirus B3，CVB3），Nancy株，由复旦大学附属中山医院卫生部病毒性心脏病重点实验室提供，在Hela 细胞中传代，冻融离心三次，上清液分装，并在Hela 细胞测50% 组织感染率（TCID50）为107，-70 0C保存备用，实验用量为1×102TCID50。黄芪注射液10mL（20g）/支，成都地奥九泓制药厂生产（批准文号：国药准字Z51021776）。兔抗小鼠的MIP-2单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司，Trizol试剂、SuperscriptⅡ逆转录试剂盒及PCR试剂盒均购于美国Invitrogen公司，MIP-2和GAPDH引物由上海生工生物技术有限公司合成。1.2　实验动物、分组及模型制备雄性Balb/c 小鼠40只购于复旦大学动物实验科学部（批号：SCYK沪2002-0002），4周龄，纯种，体重12～16g。将其随机分为3组：对照组（n=10），模型组（n=15）和治疗组（n=15）。模型组和治疗组腹腔注射0.1 mL 内含1×102 TCID50 CVB3的病毒液建立VMC模型，对照组腹腔接种0.1 mL不含CVB3的Eagle’培养液。病毒接种日为0天。治疗组于接种病毒后0.5h腹腔注射黄芪注射液10g/kg?d，其余2组腹腔注射等容积的生理盐水，1次/d，连续2周，2组动物在相同条件下饲养，记录各组每天存活小鼠数。第14天断颈处死全部存活小鼠，摘眼球法取外周血并分离出血清（3000r/min，离心10min），保存于-200C冰箱中，然后无菌取出心脏，将心脏沿左室中线切为两半，一半用40g/L甲醛固定，石碏包埋后，作病理组织学检测；另一半迅速放入液氮，再转移至-700C冰箱保存用于提取总RNA和蛋白。1.3　血清肌钙蛋白cTnI的测定取50μL上述血清，置于Dade Behring Inc公司生产的肌钙蛋白检测标准试剂块上，用化学发光法定量检测cTnI。1.4　病理学检查常规苏木素-伊红（H.E）染色，200倍光镜下观察心肌病理改变，并根据文献方法[4]计算心肌病变（炎性浸润及坏死）积分， 即每张切片随机取5个高倍视野，计算每个视野中炎性细胞浸润及坏死区域面积与整个视野的面积之比，无病变计0分，病变面积<25%计1分，25%～50%计2分，50%～75%计3分，> 75%计4分。1.5　逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测心肌组织中MIP-2mRNA表达采用Trizol试剂一步法提取心肌总RNA，获得的RNA按SuperscriptⅡ逆转录试剂盒说明合成cDNA，按PCR试剂盒说明进行DNA扩增。MIP-2引物序列：上游5-CTG CAC CAC CAA CTG CTT AC-3，下游：5 - GTC TGG GAT GGA AAT TGT GT -3，PCR产物长度为660bp;内参照基因GAPDH引物序列：上游：5-CGG AAT TCG CCA CCA TGC AGG TCC CT -3， 下游：5- GCT CTA GAC TAG TTC ACT GTC ACA CT -3，扩增产物长度468bp。PCR反应条件：94 0C预变性4 min，然后94 ℃变性45 s→57 ℃退火45s→72 ℃延伸1.5 min,27个循环，最后在72℃延伸 10 min。取上述PCR产物5μL，在含1.5%溴乙锭的琼脂糖凝胶电泳分离后，扫描仪扫描，用Total lab分析软件进行条带扫描分析，计算MIP-2 PCR产物吸光度与GAPDH产物吸光度之比值，作为MIP-2 mRNA相对含量，并重复3次独立实验。1.6　Western blot检测心肌组织中MIP-2蛋白表达将心肌组织液氮碾磨，三去污裂解液裂解。BCA assay reagent测定蛋白浓度，50μg蛋白与加样缓冲液混合，在10%不连续十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳胶中电泳分离，电转移至PVDF膜，孵育一抗、二抗，以β-actin为内参照，用ECL发光法显色，曝光、显影、定影。胶片条带用薄层扫描仪进行扫描后，运用Imager2200软件分析各产物积分光密度值，MIF积分光密度值与β-actin积分光密度值比值作为MIF蛋白相对表达量。1.7　统计学处理全部资料用SPSS 13.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（x-±s）表示，生存率采用Kaplan-Meier分析，组间比较行单因素方差分析及两两比较q检验，相关性分析采用直线相关分析，P<0.05为差异有显著性。2　结　果2.1　各组小鼠生存率比较对照组无小鼠死亡，模型组第2～5天各死亡1只，第6天死亡2只，第7天死亡1只，生存率为53.33%（8/15），治疗组第3、4、6天各死亡1只，生存率为80.00%（12/15），生存分析结果显示，治疗组生存率较模型组提高（P<0.05）。2.2　心肌病理组织学变化对照组心肌排列规则，胞浆着色均匀，无炎性细胞浸润；模型组可见大量的炎性细胞浸润、心肌纤维断裂和部分心肌组织坏死，呈现典型的VMC改变；治疗组病变明显减轻，仅出现少量的坏死灶和炎性细胞浸润。治疗组心肌病理积分明显低于模型组，差异有显著性（P<0.01），见图1和表1。2.3　各组血清cTnI水平比较对照组血清中存在低水平的cTnI，模型组cTnI水平较对照组显著升高，显著性（P<0.01），经过黄芪干预治疗后， 治疗组cTnI水平下降，两组比较差异有显著性（P<0.05），见表1。图1　心肌组织病理学变化（HE×100）表1　各组病理积分、cTnI及MIP-2 mRNA、蛋白表达水平比较2.4　心肌组织中MIP-2 mRNA 的表达条带密度扫描及半定量分析显示，模型组心肌MIP-2 mRNA表达水平较对照组明显增高，差异有显著性（P<0.01），而治疗组心肌MIP-2 mRNA表达水平明显低于模型组（P<0.05），见图2和表1。图2　各组小鼠心肌MIP-2 mRNA表达M：Marker;1：对照组；2：模型组；3：治疗组2.5　心肌组织中MIP-2蛋白的表达Western blot结果显示，与对照组比较，模型组MIP-2 蛋白表达水平显著增加（P<0.01），而黄芪治疗后，治疗组MIP-2蛋白表达水平较心肌炎模型组明显降低（P<0.05），见图3和表1。图3　各组小鼠心肌MIP-2蛋白表达A：正常对照组；B：心肌炎模型组；C：黄芪治疗组2.6　模型组MIP-2蛋白的表达与病理积分和cTnI的相关性分析直线相关分析表明，模型组中MIP-2蛋白的表达水平与病理积分呈显著正相关（r=0.89， P<0.01），与cTnI亦呈正相关（r=0.74， P<0.05）。3　讨　论VMC是由嗜心肌病毒侵犯心肌引起的心肌炎症，引起VMC的病原体有多种，其中以CVB3最常见。目前认为病毒的直接作用和机体的免疫反应是VMC的主要发病机制，其中免疫反应引起的炎症细胞的浸润和心肌细胞的坏死是VMC急性期最具特征性的病理变化[5]。MIP-2是1988年Wolpe等用脂多糖刺激鼠巨噬细胞系RAW246.7，在上清液中首次分离到的蛋白质。MIP-2来源于多种细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞、血管内皮细胞等。MIP-2是一种碱性蛋白，分子量为6KD，其cDNA编码100个氨基酸，成熟的蛋白质有73个氨基酸残基。MIP-2的主要生物学功能是趋化和活化中性粒细胞和淋巴细胞参与炎症反应。MIP-2的肝素结合位点可与内皮细胞相互作用，上调白细胞表面黏附分子CD11b/CD18的表达，最终引导白细胞穿越血管壁到达炎症部位[6]，从而在许多炎症性疾病的发生和发展中发挥重要作用。cTnI是近几年来发展起来的反映心肌细胞损伤的血清标志物，具有高度的敏感性和特异性。本研究发现，与对照组比较，模型组病理积分、血清cTnI水平、心肌MIP-1mRNA及蛋白表达水平均明显增高，且MIP-1蛋白表达与病理积分和cTnI呈正相关目前，与文献报道相符[7]，提示MIP-2参与了VMC的发生发展过程，并与病变严重程度、心肌细胞的损伤密切相关，可作为病情评估和预后判断的观察指标。其机制可能与其增加中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等炎症细胞向心肌浸润，加重心肌炎症反应有关。Kisimoto等[8]研究发现，皮下注射MIP-2单克隆抗体可明显缓解VMC小鼠心肌病变和心肌损伤，心肌浸润的巨噬细胞、淋巴细胞显著减少，并且呈剂量依赖性。因此，抑制MIP-2的表达可能成为治疗VMC的一个潜在的、有价值的靶点。黄芪又名绵黄、独根、二人抬，为豆科植物膜荚黄芪和蒙古黄芪的干燥根，具有补气升阳、益卫固表、利尿消肿、托毒生肌之功效，擅益气理虚、伏正固本。现代药理学研究证明，黄芪含有多糖、皂甙、黄酮和微量元素等多种成分，皂甙类有明显的抗病毒及正性肌力作用，多糖类则明显具有调节免疫的功能。动物实验和临床研究证实，黄芪对VMC有良好的治疗作用，具有抑制病毒复制，改善心功能、减轻心肌病理改变等疗效[9]。但对其作用机制不完全清楚。本研究中，VMC小鼠给予黄芪注射液干预治疗后，小鼠生存率提高，心肌病理积分和血清cTnI水平降低，MIP-2mRNA和蛋白表达水平明显下调，与模型组比较差异均有显著性，提示抑制MIP-2表达可能是黄芪治疗VMC的机理之一，这为黄芪的进一步开发应用打下基础，其机制可能与抑制MIP-2表达减少了炎性细胞向心肌的浸润有关。由于黄芪含有多种成分，具体是什么成分使得VMC小鼠MIP-2的表达减少，或者是某些成分的共同作用，这有待于以后的进一步研究来阐明。【参考文献】[1]曾玉兰， 杨荣时， 彭红星。 盐酸氨溴索对吸烟诱导的支气管炎大鼠MIP-2的影响[J]. 中国现代医学杂志，2009,19（17）：2585-2587.Njoku DB， Li Z， Mellerson JL， et al.IP-10 protects while MIP-2 promotes experimental anesthetic hapten-induced hepatitis[J].J Autoimmun， 2009; 32（1）： 52-59.[3]国家九五攻关全国协作组。急性病毒性心肌炎的药物治疗观察[J].中华心血管病杂志，1999,17（7）：413-415.[4]于小华，李双杰，张　平。 纳米α-亚麻酸对病毒性心肌炎小鼠巨噬细胞移动抑制因子表达的影响[J]. 实用儿科临床杂志， 2009， 24（13）： 976-978.[5]Dennert R， Crijns HJ， Heymans S. Acute viral myocarditis[J]. Eur Heart J， 2008， 29（17）：2073-2082.[6]Lomas-Neira JL， Chung CS，Wesche DE， et al.In vivo gene silencing （with siRNA） of pulmonary expression of MIP-2 versus KC results in divergent effects on hemorrhage-induced， neutrophil-mediated septic acute lung injury[J].J Leukoc Biol， 2005,77（6）： 846-853.[7]Kishimoto C， Kawamata H， Sakai S， et al. Enhanced production of macrophage inflammatory protein 2 （MIP-2） by in vitro and in vivo infections with encephalomyocarditis virus and modulation of myocarditis with an antibody against MIP-2[J]. J Virol， 2001,75（3）：1294-1300.[8]Kishimoto C， awamata HK， Sakai S， et al.Role of MIP-2 in coxsackievirus B3 myocarditis[J].J Mol Cell Cardiol， 2000,32（4）： 631-638.[9]朱红俊， 陆　佳。 黄芪治疗病毒性心肌炎药理研究进展[J]. 中国中医急症， 2007， 16（1）：95-96.