榄香烯和姜黄素诱导晶状体上皮细胞凋亡的体外研究

作者：黄秀榕,祁明信,康可人

 【关键词】  榄香烯;,姜黄素;,晶状体;,上皮细胞；,凋亡

　　摘要: 目的  探讨榄香烯(Ele)和姜黄素(Cur)对体外培养的牛晶状体上皮细胞(LEC)凋亡的诱导效应及其机制。方法 将培养的牛LEC分别与160 μg/mL Ele和20 μg/mL Cur在CO2培养箱中共同孵育8,16,24,48,72 h,通过透射电子显微镜观察LEC超微结构;采用流式细胞术(FCM)测定LEC的DNA含量及线粒体跨膜电位(ΔΨm)。结果   LEC分别与Ele和Cur共同孵育后,电子显微镜下可观察到细胞核染色质凝集、固缩、边集、核碎裂等,均呈现典型的细胞凋亡的形态学改变。FCM分析可见典型的凋亡亚G1峰,提示细胞核内DNA含量下降,并随药物作用时间的延长而加强。FCM检测发现细胞质出现线粒体ΔΨm下降,且在药物作用早期已发生变化。结论 Ele和Cur能显著诱导LEC凋亡;细胞核内DNA含量下降、细胞质内线粒体ΔΨm降低,分别是Ele和Cur诱导LEC凋亡的细胞核和细胞质途径。线粒体ΔΨm下降是Ele和Cur诱导LEC凋亡的早期事件。

　　关键词: 榄香烯; 姜黄素; 晶状体; 上皮细胞； 凋亡

　　Experimental Study on Apoptosis of Lens Epithelial Cells Induced by Elemene and Curcumin in vitro

　　Huang Xiurong, Qi Mingxin, Kang Keren

　　1.The Research Center of Pathophysiology;

　　2.The Second Affiliated People's Hospital,Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, China

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the effect and the mechanism of elemene(Ele) and Curcumin(Cur) on apoptosis of lens epithelial cell(LEC) in vitro.Methods The bovine LEC cultured with 160 μg/mL Ele and 20 μg/mL Cur were observed by using transmission electron microscopy. The changes of DNA content and mitochondrial transmembrane potential(ΔΨm) in LEC were detected by flow cytometry. Results The typical morphological changes of LEC apoptosis in Ele and Cur group were observed under transmission electron microscope, such as chromatin condensation and aggregation at the nuclear periphery, and nuclear fragmentation as well. The DNA content of LEC in Ele and Cur group decreased timedependently.        The ΔΨm of LEC in Ele and Cur group decreased from early stage. Conclusion Ele and Cur can remarkably induce apoptosis of LEC in vitro. The decrease of DNA content in LEC nucleus and the collapse of mitochondrial transmembrane potential(ΔΨm) in cytoplasm are the nucleu and cytoplasm events of apoptosis mechanisms. The decreased of ΔΨm induced by Ele and Cur is the early event of LEC apoptosis.

　　KEY WORDS: elemene; curcumin; lens; epithelial cell; apoptosis

　　白内障囊外摘除联合人工晶状体植入术是目前白内障手术的主要方法,其近期疗效已十分肯定。但术后发生的后囊混浊,又称后发性白内障,导致远期视力下降是其主要的并发症之一。白内障术后残留的晶状体上皮细胞(lens epithelial cell,LEC)在晶状体囊膜上的增生、移行、产生胶原,是发生后囊混浊的主要原因。寻求高效低毒的防治后发障的药物具有重大意义[1]。有研究表明,从中药莪术中提取的挥发油榄香烯(elemene,Ele)可阻滞细胞从DNA合成期(S期)进入合成后期/分裂期(G2/M期),抑制肿瘤细胞增殖并导致细胞凋亡[23]。从姜科植物的根茎姜黄中提取的姜黄素(curcumin,Cur)具有抗氧化、抗增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长等作用,且毒副作用小,故日益受到关注[47]。笔者采用电子显微镜及流式细胞仪(flow cytometry,FCM),通过观察LEC的凋亡形态改变、检测LEC的DNA含量及线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potential,ΔΨm)的改变,探讨Ele和Cur诱导LEC凋亡及其细胞学和分子生物学机制,为从天然药物中寻求防治后发性白内障的药物提供科学的实验依据。

1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 试剂       

　　榄香烯乳(大连金港制药有限公司,批号0110113),姜黄素(美国Sigma公司),DMEM培养液(dulbecco’s modified eagle’s medium,美国Gibco公司),胎牛血清(FBS,杭州四季青生物工程材料有限公司),胰蛋白酶(Trypsin,美国Amresco公司),乙二胺四乙酸(EDTA,美国Augus公司),碘化丙啶(PI,美国Sigma公司),核糖核酸酶A(RNase A,北京华美生物工程公司),细胞凋亡线粒体流式检测试剂盒(MitoCapture mitochondrial apoptosis detection kit,美国Bio Vision公司)。

　　1.1.2 仪器       

　　二氧化碳培养箱(3112A,美国Forma公司),透射电子显微镜(Hu12A,日本日立公司),倒置相差显微镜(日本Olympus公司),低温冰箱(日本Sanyo公司),流式细胞仪(FACScan,美国BD公司),微量移液器(法国Gilson公司),细胞培养皿及细胞培养瓶(丹麦NUUC公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 晶状体上皮细胞原代和传代培养       

　　取健康新鲜小牛眼,无菌操作撕取晶状体前囊膜,采用贴壁法在二氧化碳培养箱中进行细胞原代和传代培养。

　　1.2.2 分组      

　　(1)正常组:DMEM维持液3 mL(含5%FBS,青霉素100 U/mL,链霉素100 μg/mL);(2)H2O2组:DMEM维持液+30%H2O2(终浓度为300 μmol/L),每8 h加入首次量的60%,以保持培养液中H2O2浓度为300 μmol/L;(3)Ele组:按作用时间分成Ele 8,16,24,48和72 h组,每组含DMEM维持液+Ele(终浓度160 μg/mL);(4)Cur组:按作用时间分组同Ele组,每组含DMEM维持液+Cur(终浓度20 μg/mL)。                　　取生长良好的第3~5代LEC细胞传代于50 mL培养瓶中,常规培养48 h后,细胞处于对数生长期。按上述分组加入不同药物,并置二氧化碳培养箱孵育。Ele和Cur分别作用8,16,24,48和72 h。经不同作用时间后,收集细胞进行检测。

　　1.2.3　LEC超微结构制片       

　　取正常组及Ele 24,48,72 h组和Cur 24,48,72 h组的LEC,消化,离心(1000 r/min×5 min),去培养液,收集细胞约1×106mL1。将离心后的细胞于3%戊二醛1.5%多聚甲醛混合液中固定,4 ℃过夜。1%锇酸后固定,醋酸铀快染,乙醇丙酮脱水,环氧树脂618包埋,超薄切片,醋酸铀和枸橼酸铅双重染色。透射电子显微镜75 kV条件下观察细胞超微结构,摄影。

　　1.2.4 Ele和Cur对LEC核DNA含量的影响       

　　取正常组、H2O2组、Ele 24,48,72 h组和Cur 24,48,72 h组的细胞,参照文献[8]FCM测定DNA含量方法,用DNA结合染料PI染色后经FCM分析,可在G1峰前出现一亚G1峰,即凋亡峰(蓝色波峰),根据凋亡峰的百分率可检测出凋亡率。凋亡率高,表示DNA含量降低多、细胞凋亡多。

　　1.2.5 检测LEC ΔΨm改变       

　　于LEC孵育8,16,24,48和72 h收集正常组、H2O2组、Ele组和Cur组的1×106mL1细胞,按细胞凋亡线粒体流式检测试剂盒(美国Bio Vision公司)的检测方法,取线粒体试剂1 μL稀释到预暖的孵育缓冲液1 mL中,在微型旋蜗混合仪上振荡溶液2 min,离心(12000 r/min,1 min),转移上清,去除颗粒及干扰碎片。将上清液重悬细胞在CO2培养箱中避光孵育15~20 min。离心(1000 r/min,5 min)细胞悬液,去上清,收集细胞。加入预暖的孵育缓冲液1 mL重悬细胞,立即上流式细胞仪进行分析。正常细胞在线粒体中聚集的Mito Capture染料发出红色荧光,可在PI频道被检测(UL);而凋亡细胞中,Mito Capture染料以单体形式存在于细胞质中,发出绿色荧光,可在FITC频道被检测到(UR)。根据FITC(+)细胞的百分率可反映细胞中ΔΨm下降的程度。

1.3　统计学处理       

　　数据用x±s表示。采用SPSS软件t检验。

　　2 结果

　　2.1 Ele和Cur对LEC超微结构的影响       

　　正常组LEC超微结构基本正常,质膜完整,表面有较多的细长的绒毛突起。细胞质内线粒体丰富。细胞核内染色质呈网状均匀分布。Ele和Cur组LEC超微结构的变化相似,多数LEC呈现凋亡各期的不同改变:凋亡早期(24 h)细胞形状规则,核膜完整、核内染色质开始轻度凝集;凋亡中期(48 h)核内染色质边集、分布于核膜下;或凝聚成块,凝集的染色质呈环形、马蹄形等不同形状,常聚集于核的一侧;核仁多消失。有的胞核碎裂,染色质块散在于胞质内或质膜下。细胞外形尚规则,质膜尚完整。随着作用时间延长(72 h),细胞出现凋亡继发性坏死的形态改变,细胞质基质密度变淡,线粒体和内质网扩张、破裂,细胞质崩解、质膜残缺不全(图1)。

　　2.2 Ele和Cur对LEC DNA含量的影响       

　　经FCM分析,在G1峰前出现一亚G1峰,即凋亡峰(图2),表明LEC中DNA含量降低;而正常组不出现凋亡峰。Ele和Cur与LEC共同孵育48,72 h,LEC的凋亡率与正常组差别有统计学意义(P<0.01,表1)。

　　2.3 Ele和Cur对LEC ΔΨm的影响       

　　FCM分析显示,经Ele作用后的LEC在FITC频道右上象限(UR)检测到的细胞数增多(图3),说明这些细胞中线粒体ΔΨm下降的程度大,发生凋亡的细胞多。表1各组牛晶状体上皮细胞的凋亡率（略）　　　　Ele和Cur作用LEC不同时间的细胞的ΔΨm与正常组均有显著差异。尽管Ele和Cur作用LEC不同时间后ΔΨm的变化趋势不一,但Ele和Cur作用于LEC早期(8 h),细胞的ΔΨm均已出现显著的改变(P<0.01),以Ele尤为明显(表2)。表2 榄香烯组和姜黄素组牛晶状体上皮细胞线粒体跨膜电位的变化（略）

　　3 讨论

　　3.1 Ele和Cur均可明显诱导LEC凋亡       

　　本研究用电子显微镜观察发现,Ele和Cur组大多数LEC的细胞核内染色质发生凝集、固缩、边集,在细胞核膜周边聚集成环行、马蹄形;细胞膜表面微绒毛和伪足减少或消失,呈现典型的细胞凋亡超微结构变化。随着Ele和Cur作用时间延长,LEC细胞质内出现线粒体和内质网扩张、破裂、细胞质崩解、质膜残缺不全等凋亡继发性坏死的形态改变。FCM检测结果也表明,正常组的LEC不出现凋亡峰;Ele和Cur孵育后的LEC均出现凋亡峰。药物作用时间越长,凋亡率越高,说明降低细胞核的DNA含量是Ele和Cur诱导LEC凋亡的机制之一。

　　3.2 细胞质内ΔΨm下降是Ele和Cur诱导LEC凋亡的的早期事件        　　近年的研究发现,细胞凋亡有细胞核和细胞质两条途径[9]。有证据显示,线粒体功能改变在细胞凋亡的发生中起关键性作用,因为抑制线粒体的三羧酸循环或呼吸链功能即可引起细胞凋亡;在细胞核出现凋亡性改变之前,常常先有ΔΨm的降低。Castedo等的研究发现,在细胞凋亡发生时,ΔΨm耗散的发生早于核酸内切酶的激活,一旦ΔΨm耗散,细胞就会进入不可逆的凋亡过程[10]。                　　本研究通过检测线粒体ΔΨm的改变探讨Ele和Cur诱导LEC凋亡进程的细胞质途径，结果发现,Ele和Cur作用于LEC后不同时间,ΔΨm均下降,与正常组均有显著差异;Ele和Cur作用于LEC早期(8 h),LEC已出现明显的ΔΨm下降,FITC(+)细胞百分率与正常组比,差别有统计学意义(P<0.01),说明线粒体ΔΨm下降是Ele和Cur诱导LEC细胞凋亡级联反应中的早期事件。

　　3.3 天然药物Ele和Cur作为高效低毒防治后发性白内障药物具有广阔的应用前景       

Ele是从莪术中提取的一种倍半萜类衍生物,化学名为1甲基1乙烯基2,4二异丙基环已烷。以往的研究报道,Ele能通过激活淋巴细胞增强机体免疫功能,疗效确切且不良反应小;Ele对多种肿瘤细胞DNA、RNA的合成有明显的抑制作用[11]。Cur是姜黄中提取的一种酚性天然色素,是姜黄的主要成分,由于其色泽稳定且毒性很低(小鼠灌胃LD50>2 g/kg),目前广泛应用于食品添加剂及染料中,是咖喱、芥末中的主要色素。此外,Cur尚有抗增殖、诱导细胞凋亡等多方面的药理作用[1213]。本研究发现Ele和Cur可明显诱导LEC凋亡,并阐明了Ele和Cur诱导LEC凋亡的细胞学与分子生物学机制,为将Ele和Cur作为防治后发性白内障的药物提供了科学的实验依据。

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　　基金项目:  福建省自然科学基金项目资助(C0410030),福建省医药卫生重点资助项目(W2002502)

　　作者单位: 福建中医学院, 福州 350003         

　　1.病理生理研究中心;

　　2.附属第二人民医院眼科

　　作者简介: 黄秀榕(1948~),女,教授