腺病毒介导人内皮抑素感染视网膜色素上皮细胞的可行性研究

腺病毒介导人内皮抑素感染视网膜色素上皮细胞的可行性研究作者：张美霞，吴静，辛梅，张军军，闫乃红，严密    作者单位：四川大学华西医院 眼科，四川 成都 610041    【摘要】  目的 探讨以腺病毒为载体对体外培养的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelial，hRPE)细胞进行人内皮抑素(human endostatin，hES)感染，获得高效表达hES转基因细胞的可行性。方法 常规培养hRPE细胞，传代至第3～第5代后，应用携带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的hES重组腺病毒按感染复数30进行感染。培养24 h后，在荧光显微镜下计数培养的hRPE细胞的GFP表达阳性率;用免疫组织化学法观察hES在已感染hRPE细胞中的表达情况;提取hRPE细胞总RNA，采用RT-PCR技术对产物行琼脂糖凝胶电泳;用Western blot法检测感染hRPE细胞培养上清液中hES的表达水平。结果 hES重组腺病毒感染后，hRPE细胞形态正常，感染后24 h，GFP即呈100%表达，弥漫整个胞质;免疫组织化学法观察可见，hRPE细胞浆内呈棕黄色的阳性反应，而在感染空载腺病毒的对照组中细胞胞浆无染色;RT-PCR反应可见，细胞裂解产物中有hES阳性条带;Western blot法检测结果表明，培养上清液中有hES蛋白的表达。结论 hES重组腺病毒载体能有效感染体外培养的hRPE细胞，并稳定表达hES蛋白。    【关键词】  视网膜色素;上皮细胞;腺病毒;内皮抑素类;感染    The feasibility of an adenovirus-mediated delivery of human endostatin in cultured human retinal pigment epithelial cells　ZHANG Meixia， WU Jing， XIN Mei， et al.Department of Ophthalmology， West China Hospital， Sichuan University， Chengdu China， 610041　　[Abstract] Objective To obtain transgenic human retinal pigment epithelial (hRPE) cells by using an adenovirus-mediated delivery of the cDNA of human endostatin (hES). Methods The hRPE cells were cultured in the usual way， and the cells were then infected by two passages using a recombinant hES adenovirus vector at a dosage of MOI (multiplicity of infection) 30. The expression of GFP in hRPE cells was examined using a fluorescence microscope at 24 h after infection. The production of hES mRNA and protein was evaluated by RT-PCR and immunohistochemistry. The expression of the hES protein in the supernatant fluid of infected hRPE cells was detected by Western blot. Results GFP expression in hRPE cells could be detected 24 h after infection and the positive ratio was almost 100%. Immunohistochemistry showed all hRPE cells expressing the hES protein. The RT-PCR result was detected in a specific band with a length of about 623 bp in the genomic DNA. Western blot showed hES protein expression in the supernatant fluid of infected hRPE cells. Conclusion The recombinant hES adenovirus vector can effectively infect cultured hRPE cells and the infected cells show a high expression of hES.　　[Key words] retinal pigment; epithelial cells; adenovirus; endostatins; infection　　眼底新生血管性疾病是导致患者视功能减退甚至致盲的主要原因之一，严重影响患者的生活质量，目前仍无有效的药物治疗方法。内皮抑素(endostatin，ES)作为抗血管疗法中最具有潜力的药物蛋白[1]，由于产生作用所需的蛋白量很大，需反复注射用药，且价格非常昂贵，其应用受到限制[2]。采用基因治疗的方法，在体内直接表达ES，可避免其体外失活快和需反复注射的缺点。为进一步研究ES在眼底新生血管形成基因治疗上的应用，我们观察了腺病毒携带人内皮抑素(human endostatin，hES)对体外培养人视网膜色素(human retinal pigment epithelial，hRPE)细胞的感染及感染后hES表达的情况，为体内基因治疗奠定基础。1 材料和方法　　1.1 材料 四只角膜移植后供体眼来自健康成年男性意外死亡志愿捐献者。hES腺病毒(由四川大学华西医院眼科实验室构建)，DMEM培养基(美国Sigma公司)，热灭活的小牛血清(北京哈里生物公司)，羊抗人内皮抑素多克隆抗体(美国R&D 公司)，生物素标记山羊抗鼠IgG二抗(Zymed公司)，总RNA提取试剂TrizolTM(美国Gibco BRL公司)，PmeⅠ、PacⅠ、KpnⅠ、HindⅢ内切酶、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs(立陶宛MBI公司)，其余各种试剂均为进口或国产分析纯试剂。　　1.2 方法 取角膜移植后的供体眼，在无菌条件下自锯齿缘后剖开眼球，弃去眼前节，分离并去除玻璃体和视网膜神经上皮，制成RPE眼杯。用PBS液轻轻漂洗RPE杯2次，加消化液消化，用吸管轻轻吹打使hRPE细胞脱落，然后参照文献[3]方法进行细胞培养及传代。取第3～第5代细胞用于实验。　　1.2.1 荧光显微镜计数绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)阳性表达率 以1×105个/ml的细胞密度接种1 ml细胞悬液于六孔板中，置于CO2孵箱中培养，待细胞密度达到80%～90%汇合的单层时，按照感染复数(multiplicity of infection，MOI)为30加入hES腺病毒，一板加入空载腺病毒对照，一板作为空白对照，置于CO2孵箱中培养。24 h后吸弃病毒悬液，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，检测感染率，计算如下：感染率=发荧光细胞个数/同一视野下所有细胞个数×100%。　　1.2.2 RT-PCR法检测hRPE细胞中hmRNA的表达 感染24 h后，将培养瓶中的培养液倒掉，用PBS液冲洗细胞2次，冲洗干净残余培养液，加入每孔1 ml Trizol Reagent，用吸管反复冲洗瓶壁，将细胞完全溶解，将溶解有细胞的Trizol Reagent转移到1.5 ml DEPC处理的EP管中，4℃，12000 r/min离心10 min，去除不溶解之物，将上清液移至DEPC处理的EP管，室温下孵育5 min，加入0.2 ml氯仿，剧烈振荡，充分混匀后，室温下孵育3 min，4℃，12000 r/min离心15 min。小心吸取含有RNA的水，转移至另一DEPC处理的EP管中，加入0.5 ml异丙醇，混匀后静置，室温孵育10 min，4℃，12000 r/min离心10 min。将上清液弃去，管底沉淀即为RNA，加入经DEPC处理过H2O的75%乙醇1 ml，轻轻颠倒洗涤EP管管壁，小心弃去乙醇，清洗RNA 2次，4℃，7500 r/min离心5 min，去上清液，在超净工作台中自然干燥RNA沉淀。50 ?滋l DEPC处理水溶解，5 ?滋l作1%琼脂糖凝胶电泳。实验组和对照组分别标记后于-85℃保存。根据目的基因序列设计引物：上游引物5′-TTT GGTACC ATG AAG TGG GTG ACC TTC ATC T-3′，下游引物5′-TTT AAGCTT CTA CTT GGA GGC AGT CAT GAA GCT GT-3′，采用MBI公司的RevertAidTM Frist Strand cDNA Synthesis Kit，在PCR仪上进行扩增，将反应产物取8 ?滋l作1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测扩增目的基因cDNA片断的质量。　　1.2.3 免疫组化鉴定(S-P法) hRPE内hES的表达　　hRPE细胞制成细胞爬片，加入重组hES腺病毒，对照组加入空载体，24 h后取出盖玻片，用PBS液振洗，干燥。以一抗羊抗人内皮抑素、二抗生物素标记的鼠抗羊IgG进行常规S-P法免疫组化染色。　　1.2.4 Western blot法检测感染上清液中hES的表达 hES腺病毒感染hRPE细胞后24 h，收集上清液，最后浓缩为4 μg/μl，加载样缓冲液后，终浓度为2 μg/μl，上样量为30～80 μg/泳道，行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行蛋白质的电转移，膜封闭，滴加羊抗人内皮抑素多克隆抗体(15 μg/ml)及二抗，加入已配好的DAB显色液，显色后照相。2 结果　　2.1 荧光蛋白表达结果 hES腺病毒感染后，hRPE细胞形态正常，感染后8 h即开始出现GFP表达，24 h即可见全部hRPE细胞表达GFP，感染效率达到100%。GFP的表达在荧光显微镜490 nm波长激发光下呈黄绿色，弥漫于整个胞质中(见图1)。　　2.2 免疫组化检测结果 免疫组织化学检测感染hES腺病毒后，hRPE细胞浆内可见棕黄色的阳性反应，在感染空载腺病毒的对照组中细胞胞浆无染色(见图2)。　　2.3 RT-PCR检测结果 提取感染hES腺病毒的或空载腺病毒的hRPE细胞总RNA行RT-RCR反应，产物经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，可见hES腺病毒感染hRPE细胞总RNA样品中含有大小为623 bp左右的特异条带，而感染空载腺病毒的hRPE细胞未见条带(见图3)。　　2.4 Western blot法检测结果 Western blot法观察到，hES腺病毒感染后，hRPE细胞培养上清液在分子大小约为20 kD处出现单一蛋白条带，感染空载腺病毒的对照组无特异条带出现(见图4)。3 讨论　　我们的前期实验表明，ES可以有效抑制氧致视网膜小鼠模型的视网膜新生血管的生成[4-5]，但由于蛋白治疗的缺点限制了其有效应用。基因治疗在理论上可以有效地克服蛋白用药的缺点，选择合适的载体和靶细胞，有可能实现ES在眼部细胞中的长期稳定表达，直接作用于眼底新生血管。并且由于眼球因血-眼屏障和全身循环相对独立，减少了作用于眼部的载体影响眼外器官的机会，使得其对全身的副作用最小，在眼局部的治疗效果最大，这是基因治疗眼部疾病的优势之一。基因治疗的基本组成元件是：载体(病毒载体、非病毒载体)、转导基因(外源基因)和靶细胞。因此，选择合适的载体和靶细胞，决定着基因治疗的成败。　　目前，基因治疗常用的载体多为病毒载体，其中尤以腺病毒载体在临床和科研中应用最为广泛。腺病毒为双链DNA病毒，它的宿主范围广，临床前的研究表明，腺病毒载体DNA可以在肝脏、骨骼肌、心脏、脑、肺、胰腺和肿瘤组织中表达[5]，可感染分裂和非分裂终末细胞如神经元细胞，并且易于制备、纯化和浓缩，滴度高、感染效率高，以其为基因转移载体，可以制成胶囊或溶液。腺病毒DNA不整合受体细胞基因组，没有使抑癌基因失活和使原癌基因激活的潜在可能性，其控制转录复制单位E1基因和编码毒性产物E3基因已被剔除，因而不会自身复制，从而可以减少外源性基因可能产生的不良反应。腺病毒载体对人体致病性低，可以快速感染大多数人体细胞;另外，腺病毒载体可以携带较大的DNA片段。由此可见，与其他载体系统相比，腺病毒载体具有较强的优越性。所以本实验应用腺病毒构建的ES载体，并且携带有GFP标记，可以直接通过荧光显微镜观察感染是否成功。　　基因治疗需要在体内有合适的靶细胞，那么眼内有哪些细胞可以作为基因转染的靶细胞?目前研究表明，视网膜色素上皮(RPE)细胞、视网膜血管内皮细胞、周皮细胞、Müller细胞均能作为转染的靶细胞。RPE置于缺氧状态下培养时，其血管内皮生长因子mRNA表达及蛋白合成分泌增加，缺氧RPE细胞条件培养液能显著刺激毛细血管内皮细胞增殖，提示RPE细胞在视网膜新生血管生成中起重要作用;另外，RPE细胞接受外源性基因的能力较强[6]，可以作为抗视网膜新生血管生成基因治疗的靶细胞。因此，本实验应用hRPE细胞作为靶细胞进行感染。　　眼部新生血管的基因治疗研究已经证明，在动物模型中，应用腺病毒载体能有效表达色素上皮源性因子[7]。我们的前期研究表明，ES在氧致视网膜病变中能有效抑制新生血管的生成[4-5]。另外，ES在老年性黄斑变性患者的RPE细胞、Bruch膜及新生血管中有表达[8]，提示ES在眼内新生血管中起着重要的作用。我们构建的hES腺病毒表达载体已经证实能有效分泌ES蛋白[9]，因此将此载体应用到眼内靶细胞RPE中。　　构建的hES腺病毒体外能否有效感染hRPE细胞是实验的关键步骤。通过预实验，我们发现当感染复数(MOI)为30时，体外感染的效果最好，MOI过低或过高均会影响到感染效率。本实验hES腺病毒体外感染hRPE细胞24 h以后，在荧光显微镜下可以看到几乎所有的hRPE细胞都被感染。提取细胞总RNA后进行RT-PCR检测，结果表明hRPE细胞中有ES mRNA的表达，这表明目的基因已经被腺病毒载体有效地导入hRPE细胞中。通过免疫组化反应，可以看到hRPE细胞胞浆里有强阳性反应，同时Western blot检测到培养上清液中有ES蛋白表达，这表明ES基因在hRPE细胞中能很好地表达出目的蛋白，并且分泌到了细胞外，这就为基因治疗眼底新生血管奠定了基础。【参考文献】　　[1] O′Reilly MS， Boehm T， Shing Y， et al. Endostatin：an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth[J]. Cell，1997，88(2)：277-285.　　[2] Cao Y. Therapeutic potentials of angiostatin in the treatment of cancer[J]. Haematologica，1999，84(7)：643-650.　　[3] 王雨生. 视网膜色素上皮细胞培养技术及其应用[J]. 中华眼底病杂志，1996，10(2)：124-128.　　[4] Zhang M， Yang Y， Yan M， et al. Downregulation of vascular endothelial growth factor and integrinbeta3 by endostatin in a mouse model of retinal neovascularization[J]. Exp Eye Res，2006，82(1)：74-80.　　[5] 张美霞，张军军，严密. 内皮抑素抑制氧致视网膜病变小鼠新生血管形成的实验研究[J]. 中华眼底病杂志，2005，21(5)：314-317.　　[6] Bramson JL， Graham FL， Gauldie J. The use of adenovial vectors for gene therapy and gene transfer in vivo[J]. Curr Opin Biotechnol，1995，6(3)：590-595.　　[7] Campochiaro PA. Gene therapy for ocular neovascularization[J]. Curr Gene Ther，2007，7(1)：25-33.　　[8] Tatar O， Shinoda K， Adam A， et al. Expression of endostatin in human choroidal neovascular membranes secondary to age-related macular degeneration[J]. Exp Eye Res，2006，83(2)：329-338.　　[9] 闫乃红，陈清英，曹桂群，等. 人内皮抑素重组腺病毒的构建及鉴定[J]. 华西医学，2005，20(4)：633-634.