泪液中溶菌酶与转化生长因子β2的检测方法在干眼诊断中的意义

泪液中溶菌酶与转化生长因子β2的检测方法在干眼诊断中的意义作者：郝莉莉，闫志鹏，宋秀君    作者单位：河北医科大学第三医院 眼科，河北 石家庄 05000 　　【摘要】  目的 测定干眼患者和正常人泪液中溶菌酶和转化生长因子β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)的含量，为临床干眼的诊断提供更有价值的依据。方法 选择确诊为干眼症患者36例(72眼)，其中非干燥综合征患者21例(42眼)，干燥综合征患者15例(30眼)。正常人26例(52眼)作为对照组。采用微量快速比浊法和双抗体夹心ABC-ELISA法，检测被选人群泪液中溶菌酶和TGF-β2的含量。应用SPSS 12.0统计软件进行统计处理(t检验)，并对检测到的泪液中TGF-β2浓度与Schirmer Ⅰ试验值及泪膜破裂时间(tear breakup time，BUT)进行相关性分析。结果 应用微量快速比浊法检测到正常对照组、非干燥综合征组、干燥综合征组患者泪液中溶菌酶含量，分别为(12.274±1.313)?滋g/ml和(8.294±1.235)?滋g/ml及(8.446±1.113)?滋g/ml，两组干眼症组与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。采用双抗体夹心ABC-ELISA法对以上人群泪液中转化生长因子β2含量进行检测，分别为(41.518±21.304)pg/ml、(14.123±12.095)pg/ml和(4.022±8.668)pg/ml，非干燥综合征组及干燥综合征组泪液中TGF-β2浓度均明显低于正常对照组，差异有显著统计学意义(P<0.01)。分别以测得的Schirmer Ⅰ(mm)试验值及BUT(s)值为横坐标(X)，以检测到的泪液TGF-β2的浓度为纵坐标(Y)，分析它们之间的相关性。干眼组泪液TGF-β2浓度与Schirmer Ⅰ试验值及BUT均呈正相关。结论 使用微量快速比浊法检验泪液中溶菌酶含量在临床诊断干眼症中有意义，并具有标本用量少、反应时间短、灵敏度高、适合低浓度酶液检测等特点。双抗体夹心ABC-ELISA法能够有效检测泪液中TGF-β2的表达。泪液中TGF-β2浓度与Schirmer Ⅰ试验值及BUT呈正相关，表明检测泪液中TGF-β2的含量对于辅助诊断干眼症是可行的。 　　【关键词】  干眼;干燥综合征;泪液;溶菌酶;转化生长因子β2　　Significance of tear lysozyme and transforming growth factor-β2 levels for clinical diagnosis of dry eye　HAO Lili， YAN Zhipeng， SONG Xiujun.　　Department of Ophthalmology， the Third Hospital of HeBei Medical University， Shijiazhuang China， 05000　　[Abstract] Objective To determine the tear lysozyme and transforming growth factor-β2 levels of dry eye patients and normal human， to provide a basis for clinical diagnosis of dry eye. Methods Three groups of people were selected， none sj?觟gren syndrome group(21 cases， 42 dry eyes)， sj?觟gren syndrome group (15 cases， 30 dry eyes)， normal control group (26 cases， 52 healthy eyes). Turbidimetry rapid micro-detection and double-antibody sandwich ABC-ELISA method were used in the study， to determine the tear lysozyme and transforming growth factor-β2. The experimental data were analyzed with SPSS 12.0 statistical software， and the statistical methods was used with the t test. The correlation between the TGF-β2 concentration， Schirmer Ⅰ test and BUT was analyzed. Results Turbidimetry rapid micro-detection to the normal control group， none sj?觟gren syndrome， sj?觟gren syndrome group with dry tear in the lysozyme content were (12.274±1.313)μg/ml and (8.294±1.235)μg/ml and (8.446±1.113)μg/ml by statistical analysis (P<0.05); use of double-antibody sandwich ABC-ELISA method over the crowd in tears content of transforming growth factor-β2 were detected (41.518±21.304)pg/ml， (14.123±12.095)pg/ml and (4.022±8.668)pg/ml， none sj?觟gren syndrome and sj?觟gren syndrome group in the concentration of TGF-β2 were significantly lower than the normal control group (P<0.01， P<0.01)， respectively. Measured Schirmer Ⅰ (mm) test value and BUT (s) value for the abscissa (X)， so as to detect tear of transforming growth factor-β2 (TGF-β2) for the longitudinal coordinates of the concentration (Y)， the correlation between them was analyzed. TGF-β2 tear test， BUT and Schirmer Ⅰ test in dry eye group were positively correlated. Conclusion Turbidimetry rapid micro-test in the lysozyme content of tears in the clinical diagnosis of dry eye is meaningful， and with low specimens， short reaction time， accuracy， high sensitivity for detecting low concentration of enzyme， etc.; use of double-antibody sandwich ABC-ELISA assay tear in the expression of TGF-β2 that enable the detection method can effectively tear in the concentration of TGF-β2， and the concentration of TGF-β2， BUT and Schirmer Ⅰ test is positively correlated， show that the detection of tear in the content of TGF-β2 for dry eye diagnosis is feasible.　　[Key words] dry eye; sj?觟gren syndrome; tear; lysozyme; transforming growth factor-β2　　泪液中的溶菌酶(lysozyme)及转化生长因子β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)的含量均较高，有研究表明泪液中溶菌酶浓度测定比Schirmer Ⅰ试验更能准确地判断泪液分泌功能[1]。本实验对干眼患者和正常人泪液中溶菌酶及TGF-β2的浓度进行检测，并对TGF-β2的检测意义进行评估。通过与以往检测泪液溶菌酶方法进行比较，从而确立更为准确、方便、快捷，并且标本用量少、适用于低浓度酶液的检测方法，通过对泪液中TGF-β2进行检测，为干眼的临床诊断方法提供更有价值的依据。1 材料和方法　1.1 材料与设备 超低温冰箱(法国Jouan公司)，电热恒温培养箱(上海市医疗器械批发部监制)，7220型比色皿(北京瑞利分析仪器公司)，Human TGF-β2试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)， 血平板(石家庄华瑞创新生物技术开发公司)，溶壁微球菌菌株(河北省医科大学第二医院检验科)，溶菌酶标准酶试剂(美国AMRESCO公司)。　1.2 病例选择 我院眼科门诊确诊的非干燥综合征(none sj?觟gren syndrome，NSS)患者21例(42眼)，其中男10例，女11例，年龄30~67岁。风湿免疫科确诊的干燥综合征(sj?觟gren syndrome，SS)患者15例(30眼)，其中男5例，女10例，年龄33~70岁。另外选择相同年龄段的健康个体26例(52眼)作为对照，其中男12例，女14例，年龄24~69岁。　1.3 样本的采集 在征得研究对象知情同意后采集泪液，在结膜囊内滴注60 μl 0.9%生理盐水后，嘱被检者转动眼球使泪液与生理盐水充分混合，轻拉下睑结膜并微压，以毛细玻管轻置于穹窿结膜与球结膜交界处，使泪液引流入毛细玻管，分别收集左、右眼泪液，转移至同一离心管，于-20℃保存备用。以上采集过程均由同一人在相同条件下完成。　1.4 溶壁微球菌的培养 用无菌眼科镊夹持带有溶壁微球菌菌株的纸片轻涂血平板上，放置于电热恒温培养箱(35℃)20 h，待血平板表面爬满淡黄色大小不等的溶壁微球菌，用PBS液洗下菌台备用。　　溶液中溶菌酶含量的测定(微量快速比浊法) ①溶菌酶液的配制：将标准溶菌酶干粉溶于PBS缓冲液中，制成每毫升含40、30、20、10、5、2.5、1.25 ?滋g标准酶溶液。②调节菌液吸光度：置于490 nm分光光度仪检测，吸光度在0.4~0.5之间。③将200 ?滋l菌悬液加入到40 ?滋l溶菌酶液中，混匀置微型振荡器上充分振荡30 s，放入37℃水浴箱中30 min，取出后加入0.5 mol/L NaOH 20 ?滋l终止反应。再振荡后，采用波长490 nm的酶标仪，测各孔A值。④其中设置空白管加40 ?滋l PBS液、200 ?滋l菌悬液及0.5 mol/L 20 ?滋l NaOH终止液。以上各孔同时作平行样。　1.5 泪液中转化生长因子β2(TGF-β2)的测定　　1.5.1 准备试剂 ①用重蒸水1∶20稀释洗涤液。②底物工作液配制：用前将酶底物OPD片放入底物稀释液中溶解，每片加液5 ml。③标准品液配制：使用前每管加入蒸馏水200 ?滋l溶解。　　1.5.2 标本激活 ①将80 ?滋l样品稀释液加入到1.5 ml聚丙烯管中，再加10 ?滋l标本。②加5 ?滋l 1 mol/L HCL，盖紧，上下混匀，于2~8℃放置(60±2)min。③加5 ?滋l 1 mol/L NaOH，盖紧，上下混匀。　　1.5.3 检测程序 ①实验前20 min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温(20~25℃)。②建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔中各加入样品稀释液100 ?滋l，第1孔加标准品100 ?滋l，混匀后用加样器吸出100 ?滋l，移至第2孔。如此反复作对倍稀释至第7孔，最后，从第7孔中吸出100 ?滋l弃去，使之体积均为100 ?滋l。第8孔为空白对照。③加样：待测品孔每孔中各加入已激活的标本100 ?滋l。④将反应板置37℃温度中120 min。⑤洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次，向滤纸上印干。⑥每孔中加入第一抗体工作液50 ?滋l。⑦将反应板充分混匀后置37℃中60 min。⑧洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次，向滤纸上印干。⑨每孔加酶标抗体工作液100 ?滋l。⑩将反应板置37℃中60 min。?輥?輯?訛洗板同前。?輥?輰?訛每孔加入底物工作液100 ?滋l，置37℃暗处反应5~10 min。?輥?輱?訛每孔加入50 ?滋l终止液混匀。?輥?輲?訛在波长为492 nm处测吸光值。　1.6 统计学方法 采用SPSS 12.0统计软件进行统计处理，对实验数据进行t检验和相关分析。2 结果　2.1 泪液中溶菌酶的含量 在不同组所有个体泪液样本中，应用微量快速比浊法检测各组溶菌酶的含量(见表1)。NSS组患者和SS组患者泪液溶菌酶含量均明显低于对照组，经统计学分析显示，此差异均有统计学意义(P=0.026，P=0.0285)。　　以空白对照—吸光度为横轴(X)，所配制标准品浓度为纵坐标(Y)，标准曲线图见图1，酶的浓度与空白对照—吸光度值密切相关，直线回归方程为：Y=226.46X-7.85，绘制标准曲线有良好的线性关系(r=0.89，P<0.01)。　　2.1.1 正常眼泪液溶菌酶测定 溶菌酶吸光度数值呈正态分布，空白对照—吸光度平均为0.0939±0.0504。　　2.1.2 干眼病泪液溶菌酶测定 ①非干燥综合征(NSS)：21例患者均低于正常范围。②干燥综合征(SS)：15例患者中，10例患者(66.67%)低于正常范围。两组36例患者中，31例患者在正常范围以下，即86.11%干眼患者的泪液溶菌酶低于正常值。　2.2 泪液中TGF-β2浓度的检测 在不同组所有个体泪液样本中，采用双抗体夹心ABC-ELISA法，检测到泪液中TGF-β2的OD值，依据标准曲线，查出样品中TGF-β2的含量。从表2中可以看出，NSS组及SS组泪液中TGF-β2浓度均明显低于对照组，经统计学分析发现，差异均有显著统计学意义(P<0.01，P<0.01);SS组泪液中TGF-β2浓度也低于NSS组，但两者差异无统计学意义。　　分别以测得的Schirmer Ⅰ试验值及泪膜破裂时间(tear breakup time，BUT)值为横坐标(X)，以检测到的泪液TGF-β2的浓度为纵坐标(Y)，分析它们之间的相关性。干眼组泪液TGF-β2与Schirmer Ⅰ试验值呈正相关(r=0.36，P<0.05)，干眼组泪液TGF-β2与BUT呈正相关(r=0.47，P<0.05)。　　TGF-β2与Schirmer Ⅰ试验值的关系如图2。回归方程为：Y=1.90X+7.04。　　TGF-β2与BUT的关系如图3。回归方程为：Y=3.54X+4.26。3 讨论　　干眼症作为发病率较高的的眼科疾病之一，其发病原因复杂多样。激素缺乏、年龄、自身免疫性疾病、环境、角膜接触镜的配戴、睑缘炎、酒渣鼻和病毒损害等因素共同形成了干眼症的原因。　　目前干眼的诊断主要依据患者自觉症状以及较为传统的检查方法，例如SchirmerⅠ试验、BUT检查及荧光素染色检查等。虽然这些检查方法简单、经济，但重复性低，易受外界因素的影响。有报道指出，以Schirmer Ⅰ试验值降低为诊断干眼病一主要依据，其重复性差，滤纸、受检者及环境等因素均影响测定结果，可能产生15%的假阳性或假阴性结果[2]。　　本研究对干眼患者和正常人泪液中溶菌酶及转化生长因子β2进行检测，以寻求灵敏度高、特异度高、成本低、省时、省力的临床检测方法。　　溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)分子量为14400道尔顿，PI 10.5~11.0[3]，由120个氨基酸残基组成。该酶为一种天然免疫物质，广泛分布于人体泪液、唾液、乳汁、血清以及肝、肾、软骨、淋巴结、骨髓等组织中。　　1922年，Alexander Fleming最早报道泪液中含有溶菌酶。泪液中溶菌酶浓度较血清约高150~200倍，其产生可能来自泪腺细胞。泪液中的溶菌酶含量在体外分泌液中居首位，是人眼免疫防御系统的重要组成部分。已有研究证实，测量溶菌酶浓度可以判断泪液量，溶菌酶浓度测定比Schirmer Ⅰ试验能更准确地判断泪液分泌功能[1]。　　溶菌酶的检测方法较多，如①比浊法[4]：采用溶菌小球菌(micrococcus lysodeikticus)为底物。此法对单个样品测定速度快，但操作复杂，精确度较低，实验结果产生的偏差度较大，结果的重现性不好[5]。②琼脂板扩散法[6]：是借鉴抗生素的纸片琼脂平板扩散法测定生物效价的原理建立的一种方法。此法简便，但重复性差，在扩散过程中易受到其他交叉性蛋白的干扰。③比色法[7]：此法结果不够准确，易受主观因素的影响。④琼脂糖火箭电泳法：此法简便、快速，稳定性好，灵敏度高，结果准确可靠。⑤RBB-R染料标记比色法：此法灵敏度较高，重复性较好，检测结果较稳定，适合大批量样品的检测，影响因素少，可控性好。⑥高效液相色谱法[8]：用于测定溶菌酶口腔药膜中维生素B6的含量实验，具有操作简便、快速，重复性好，结果可靠等特点。⑦微量快速比浊法：由于溶菌酶能使溶壁微球菌(mlysocleikticus)溶解，吸光度减低，故其减低的程度与溶菌酶的含量成正比。根据标准曲线可换算出溶菌酶含量。此法采用聚苯乙烯反应板，以酶标仪检测吸光度，具有线性关系好、标本用量少、反应时间短、准确、灵敏度高的特点。　　本实验应用微量快速比浊法检测正常人组、非干燥综合征和干燥综合征干眼患者泪液样本中泪液溶菌酶的含量，探讨其诊断价值。通过测定溶菌酶使溶壁微球菌溶解后的吸光度，根据标准曲线换算出溶菌酶的含量。微量快速比浊检测溶菌酶的方法具有线性关系好、标本用量少、反应时间短、准确、灵敏度高的特点，适合低浓度酶液的测定[9]。　　戎冰兰等[10]利用琼脂糖免疫扩散法测得干眼患者泪液溶菌酶低于正常组眼，这与本实验测得的21例非干燥综合征(NSS)患者及15例干燥综合征(SS)患者泪液溶菌酶浓度均低于26例正常对照相符。　　TGF-β的相对分子量为25 000，在人体中只存在TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 三种异构体，免疫测定法多采用Dasch等[11]建立的用单抗检测TGF-β1和TGF-β2的夹心ELISA法。　　TGF-β2是一种多功能肽，既往研究表明，三种亚基中TGF-β2在眼部的作用占重要地位[12-13]。泪腺所分泌的TGF-β2，在泪液中含量相当高[14-15]。2004年Ozcan等[16]用ELISA法测定原发性开角型青光眼患者房水中TGF-β2的浓度。有学者利用Western blot方法检测不同病程动物模型视网膜中TGF-β2的表达。还有学者利用SABC免疫组织化学法对口腔鳞癌TGF-β2的蛋白表达进行研究。　　本实验利用双抗体夹心ABC-ELISA法检测SS和NSS泪液中TGF-β2浓度，发现它们均低于正常对照组，此差异有显著统计学意义，表明此方法在临床诊断干眼症方面有重要意义。分别绘制泪液中TGF-β2与Schirmer Ⅰ试验及TGF-β2与BUT的回归方程，结果显示TGF-β2与Schirmer Ⅰ和BUT均呈正相关。【参考文献】  　[1] Kiratli H， Irkec M， Orhan M. 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