微脉冲半导体680 nm激光对豚鼠图形视觉诱发电位的影响

　　 作者：刘兰涛，范馨燕，郭群，刘京郊，张作明    作者单位：1.第四军医大学航空航天医学教育部 重点实验室航临教研室，陕西 西安 710032;2.哈尔滨工业大学 可调谐激光国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150001;3.北方电子设备研究所，北京 100083

　　 【摘要】  目的 探讨680 nm激光对豚鼠图形视觉诱发电位(pattern visual evoked potential，PVEP)的影响。方法 20只杂色豚鼠被随机分成对照组和实验组(680 nm激光作用，北方电子设备研究所研制)，每组10只。麻醉后，在前囟(bregma)前6 mm、后10 mm及矢状缝正中处钻孔，均植入长5 mm、直径1.2 mm的不锈钢螺钉作为参考电极、记录电极和地极。3 d后，将清醒状态下的豚鼠固定于自制多功能头身一体化固定台面上，采用RET I-port系统(Roland Consult，德国)分别记录对照组和实验组图形视觉诱发电位的变化。结果 在正常条件下可以记录到豚鼠稳定的PVEP图形，呈NPN形。激光刺激对PVEP影响较大，当刺激空间频率为0.1 cpd时，对照组P1波潜伏期为(90.36±1.61)ms，实验组为(98.89±3.62)ms;空间频率0.3 cpd时，对照组P1波潜伏期为(94.07±2.36)ms，实验组为(99.46±3.18)ms;与对照组比较，实验组潜伏期均有延长(t=23.00，P=0.001;t=9.26，P=0.016)，其余空间频率差异不大。当空间频率大于等于0.5 cpd时，实验组P1波振幅分别为：0.5 cpd，(7.70±1.75)μV;0.6 cpd，(7.52±2.01)μV;0.7 cpd，(7.12±1.41)μV;0.8 cpd，(7.65±1.69)μV;0.9 cpd，(6.42±1.23)μV。对照组P1波振幅分别为：0.5 cpd，(5.71±0.73)μV;0.6 cpd，(5.15±0.20)μV;0.7 cpd，(4.60±0.93)μV;0.8 cpd，(4.65±0.83)μV;0.9 cpd，(4.49±0.45)μV。两组比较，差异均有统计学意义(t=5.56、6.87、11.21、12.80、10.81，P<0.05)。激光对视力影响比较大，随着激光能量的增加，视力明显下降。结论 植入式电极可以记录豚鼠PVEP图形，豚鼠的PVEP明显受到激光照射的影响，同时用PVEP评价动物的视力也是一种新方法。

　　 【关键词】  视觉诱发电位，图形;680 nm激光;豚鼠

　　 Effect of 680 nm-laser on pattern visual evoked potential in guinea pigs

　LIU Lantao*， FAN Xinyan， GUO Qun*， et al.

　　 Department of Aerospace Clinical Medicine， Key Laboratory of Faculty of Aerospace Medicine of Ministry of Education， Fourth Military Medical University， Xi’an， China， 710032

　　[Abstract] Objective To study the effect of 680 nm-laser on pattern visual evoked potential (PVEP) of guinea pigs. Methods Twenty guinea pigs were divided into control group and experimental group (680 nm-laser， north electronic equipment research institute)， 10 in each group. After anesthesia， the guinea pigs’scalp surface was exposed and two stainless screws (5 mm length and 1.2 mm diameter) were implanted at 6 mm in front of and 10 mm behind bregma， as reference electrode and recording electrode. In the middle， a third stainless screw was implanted as ground electrode. 3 days later， awaked guinea pigs were fixed in multifunctional head-body apparatus. RETI-port system (Roland Consult， Germany) was used to record PVEP of control group and experiment group. Results The typical wave form was NPN in normal condition. The 680 nm-laser had an evident effect on PVEP. The latency of P1 wave of experiment group was increased significantly [(98.89±3.62)ms and(99.46±3.18)ms] compared with control group (90.36±1.61)ms and (94.07±2.36)ms] when the spatial frequency was in 0.1 and 0.3 cpd (t=23.00， P=0.001， t=9.26， P=0.016)， but no significant in other spatial frequencies. The amplitude of P1 wave of experiment group[0.5 cpd， (7.70±1.75)μV; 0.6 cpd， (7.52±2.01)μV; 0.7 cpd， (7.12±1.41)μV; 0.8 cpd， (7.65±1.69)μV; 0.9 cpd， (6.42±1.23)μV] was decreased significantly compared with control group [0.5 cpd， (5.71±0.73)μV; 0.6 cpd， (5.15±0.20)μV; 0.7 cpd， (4.60±0.93)μV; 0.8 cpd， (4.65±0.83)μV; 0.9 cpd， (4.49±0.45)μV]when the spatial frequency was beyond 0.5 cpd [(t=5.56， 6.87， 11.21， 12.80， 10.81， P<0.05)]. Six hundred and eighty nm-laser had an obvious effect on visual acuity . The visual acuity decreased quickly with the laser energy increased. Conclusion Implanted electrode can record PVEP in awaked guinea pigs. The 680 nm-laser has an evident effect on PVEP. Meanwhile evaluation of animal visual acuity using PVEP is a good method.

　　[Key words] visual evoked potential， pattern; 680 nm-laser; guinea pig

视觉诱发电位(visual evoked potential，VEP)主要是由视觉刺激引起的视皮层神经元电活动，其中图形视觉诱发电位(pattern visual evoked potential，PVEP)与人的视力密切相关，因此被广泛用于临床。而豚鼠形觉功能较好，能够诱发出PVEP，并且在植入电极条件下能够记录到稳定的PVEP[1]。在临床上，不同能量的激光对视觉功能的影响不同，传统阈值或阈上值的激光通过破坏耗氧量最高的视网膜色素上皮层(retinal pigmented epithelium，RPE)及光感受器等组织达到治疗目的，但同时也存在着术后激光斑扩大、中心视觉敏感度下降、脉络膜新生血管形成及视网膜纤维化等副作用。视网膜在吸收激光后会产生一系列的生物效应，如热效应、光压效应、电磁效应、光化学效应和光刺激效应，这些变化都可能导致视网膜损伤。因此，近年有不少学者提出低强度激光，即将激光能量控制在既可达到有效治疗作用又可最大程度保护组织的范围内。微脉冲半导体激光就是其中的一种。那么微脉冲半导体激光经瞳孔直接照射眼底视网膜，是否会对眼的屈光间质及视网膜结构造成损伤，多次照射的能量累积是否引起眼部结构的损伤，这些都尚存疑问和争议。本实验通过对豚鼠眼进行微脉冲半导体680 nm激光经瞳孔照射，观察其对图形视觉诱发电位的影响，从而推测其对视觉功能的影响，以期为进一步的临床观察和应用提供参考。

　　1 　材料和方法

　　1.1 　实验动物　 健康成年雄性杂色豚鼠20只(第四军医大学实验动物中心提供) ，随机分成2组，每组10只，体重220～300 g，外眼和检眼镜查屈光间质清晰，眼底无改变，对照组和实验组均予以12 h明暗交替光照，不限食水，于18～23℃条件下适应性饲养3 d后进行电极的植入。实验组予以激光照射。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 电极植入方法 1%戊巴比妥按1.5 ml/kg腹腔注射麻醉后，将豚鼠呈俯卧位固定于手术台上，四肢及头部固定牢固，用弯剪除去头顶周部毛发，直至露出皮肤。用碘伏、75%的酒精依次进行皮肤消毒，沿头颅矢状缝剪开皮肤2 cm，根据Goksoy等[2]介绍的豚鼠脑功能定位图进行电极固定，在前囟(bregma)前6 mm、后10 mm分别做参考电极和记录电极，头顶正中做地极。缝合皮肤，放回饲养笼单独饲养，于术后第1、第3天行切口处消毒。为了减轻麻醉的影响，3 d后进行实验。

　　1.2.2 豚鼠固定 将豚鼠固定于自制多功能头身一体固定台上，然后将银-氯化银电极连接于不锈钢螺钉上，连接放大器。连接好后将其置于安静、黑暗的操作室中。为了减少外界环境对实验结果的影响，对照组和实验组的豚鼠都以右眼为测试眼，左眼用黑色蔽光罩罩上，右眼角膜缘与显示屏平行，距离显示屏中心20 cm，视角为36.9°，安静3 min后进行实验。

　　1.2.3 激光器参数 半导体激光器(北方电子设备研究所研制)，波长680 nm，脉宽10 μs，频率20 Hz，平均功率231 mW，峰值功率1155 W。激光器的出射光束经过15 mm×5 mm的小孔光阑后，以1.4 mW的平均功率作用于豚鼠眼睛，与右眼成45°角、1.3 m距离处直接照射，作用时间30 s，并同时进行PVEP测定。实验中我们选择0.3、0.5、0.8、1.1和1.4 mW四种平均功率的激光，观察它们对豚鼠视觉分辨力的影响。因为空间分辨能力可以用视力来量化[3]，因此我们采用视力来衡量空间分辨力，规定：当空间频率减小至某一方格无可辨认的P1波出现时，其上一级方格即为能诱发出VEP的最小方格，即豚鼠的视力，用cpd来表示。每次测定根据能量大小不同间隔时间5～10 min。

　　1.2.4 PVEP记录 采用RETI-port视觉电生理学记录系统(Roland Consult，德国) ，ELSA 21寸彩色显示器，棋盘格(checkerboard)翻转刺激，刺激频率为2.0 Hz，扫描时间300 ms，通频带设为5～50 Hz，叠加30次。记录时电极间电阻小于5 kΩ。按照RGB格式并且采用OptiCAL(Japan)测量亮度，刺激棋方格颜色参数分别为黑(0.0.0，5.0 cd/m2)、白(255.255.255，75.0 cd/m2)，灰度的对比度设置为97%。

　　1.3 统计学方法　 应用RETI-port软件测量PVEP的P1波潜伏期以及P1波的振幅。使用SPSS 12.0统计软件对数据进行t检验。

　　2 　结果

　　2.1 680 nm激光对PVEP的影响 正常豚鼠在清醒状态下，植入电极引导出来的波形为NPN形，与人类的PVEP诱发图形相似[1]。图形起始为一深大的负波，随后为一较大正波，后为负波后电位。经过680 nm激光照射后，PVEP波的潜伏期后移并且振幅明显减小(见图1)。激光作用后在不同空间频率下变化特点是不一样的。

　　2.1.1 潜伏期 在空间频率为0.1 cpd时，对照组P1波的潜伏期为(90.36±1.61)ms，实验组为(98.89±3.62)ms;0.3 cpd时，对照组为(94.07±2.36)ms，实验组为(99.46±3.18)ms，对照组和实验组潜伏期差异有统计学意义(t=23.00，P=0.001;t=9.26，P=0.016)。随着空间频率的增加，对照组和实验组潜伏期逐渐接近，在其余空间频率，对照组和实验组潜伏期差异没有统计学意义(P>0.05)(见图2)。

　　2.1.2 振幅 对照组和实验组的振幅随着空间频率的增加都降低，激光作用后，实验组振幅明显降低(见表1)。空间频率在小于0.5 cpd时，对照组和实验组振幅差异没有统计学意义(P>0.05);而当空间频率大于0.5 cpd时(包括0.5 cpd)，振幅差异有统计学意义(P<0.05)(见表1、图3)。

　　2.2 680 nm激光对豚鼠空间分辨能力的影响 本实验初步观察了激光能量的大小对豚鼠的空间分辨能力的影响。由于空间分辨能力可以用视力来量化[3]，所以我们以视力来表示。当空间频率减小至某一方格无可辨认的P1波出现时，其上一级方格即为能诱发出VEP的最小方格，即豚鼠的视力，用cpd来表示，取其均值作图。随着激光能量的增加，豚鼠的视力逐渐下降，尤其是激光能量大于0.6 mW时，豚鼠的视力几乎呈直线降低(见图4)。

　　3 讨论

　　图形视觉诱发电位反映了视觉信息从视网膜到大脑皮质视觉中枢信号的传递过程[4]，主要反映神经节细胞的功能。由于无创性和客观性，PVEP检查在临床上有着广泛的用处。豚鼠与人类有着较为相似的视椎、视杆细胞比例[5-6]，内核层、内网状层和光感受器细胞层的厚度与人类比较接近，提示豚鼠具有比较好的视力。激光具有的高亮度、高相干性的特点，使得其光能量在时间与空间上高度集中，其对生物体损伤反应受多方面因素影响，诸如功率、波长、照射时间和光斑等。

　　本实验中，由于激光的作用，PVEP潜伏期和振幅的变化比较明显。分析其原因可能有以下几个方面：?譹?訛可能是激光使感光细胞的视紫红质发生分解，产生感受器电位，通过一系列的信号传递到达神经节细胞，经过总和，引起神经节细胞的去极化，从而产生光感，但此时图形刺激达不到引起神经节细胞去极化的阈电位[7]，因此只能引起模糊的视觉形象(即光感受清晰，图形感受模糊)，从而表现为PVEP潜伏期的延长和振幅的降低。?譺?訛PVEP的变化可能与眼球的结构损伤有关。有研究表明，波长400～900 nm的激光束投射到角膜上，经角膜和晶状体聚焦，使视网膜在单位面积上所受激光照射的能量比相应的角膜入射量提高了近105倍[8]。虽然本实验激光能量很小，刺激时间短，但仍不排除激光聚焦后对视网膜的损伤，尤其是神经节细胞的损伤，从而造成PVEP的P1波潜伏期的延长和P1波振幅的下降。透明角膜主要吸收波长短于295 nm的紫外线及长于1900 nm的远红外线[9]，但当680 nm激光能量较高时，激光光能经含黑色素较多的豚鼠眼虹膜吸收后转化为热能，对邻近角膜内皮可能造成热损伤，从而造成豚鼠对图形的识别障碍，影响PVEP波形。因此激光能量应控制在一定范围内，避免对角膜内皮造成损伤[10-11]。680 nm激光属于可见光激光的范围，视网膜色素上皮层对此范围的激光有很强的吸收率，大约50%，而近红外激光只有8%~10%的吸收率[12]。因此，进入瞳孔的激光大部分被视网膜色素上皮层所吸收，温度上升，并向神经感觉层和周围传导，从而引起光感受器细胞的损伤。本实验虽然延长激光对豚鼠的刺激间隔时间(10 min)，但仍不能排除激光光能的累积效应对豚鼠视觉系统造成的损害。?譻?訛PVEP的改变与激光造成的失能眩光(disability glare)有关。680 nm激光属于微脉冲半导体激光，它是一种短促的阈值( 低于热损伤阈值 )下能量激光。微脉冲半导体激光已经被证实，在曝光时间不超过l00 s的情况下，微脉冲激光只对色素上皮细胞起作用，因为在极短的时间内，热量流动或从原照射区的热传递作用，对光感受器或脉络膜毛细血管的影响很少[13-14]。而且何晓静等[14]报道，微脉冲810 nm激光能量在阈下光凝作用于兔眼视网膜，组织学及电镜下观察仅见色素上皮细胞内轻微的内质网扩张，而神经节细胞、内核层、外核层变化不明显，光感受器细胞未见损害。由此推断，本实验条件下的680 nm激光影响PVEP的机制可能并不是通过损伤作用而实现的，而可能是通过眩光作用实现。眩光是一种视觉状态，它是由于视野内光照的亮度分布不恰当或亮度过强而引起的不舒适或视觉功能降低的现象，为不舒适眩光(discomfort glare)和失能眩光(disability glare)。不舒适眩光是一种心理现象，而眩光造成视功能降低，则称为失能眩光，失能眩光是由于视野中的强光降低了目标的对比敏感度和可见度，从而影响了视觉作业的效绩[15]。由于激光具有高亮度、高相干性的特点，致使豚鼠失能性眩光，从而导致对图形辨别能力的下降，进而影响PVEP。综上所述，本实验条件下，激光对豚鼠PVEP的影响可能是通过以上三方面的作用实现的。

　　梅军等[16]对不同视力患者进行PVEP检查，发现P100振幅明显降低(P<0.01)，潜伏期无明显变化(P>0.05)，进行相关分析后发现视力与振幅呈正相关(r=0.588)，他们认为振幅是反应视力主要指标。本实验结果发现，随着空间频率的增加，P1的振幅明显降低。与对照组比较，实验组刚开始变化并不是很明显，这可能是，在同一种功率激光的照射下，豚鼠视网膜对低空间频率的图形还能辨认，但是随着空间频率的增高，对图形的分辨率迅速降低，尤其是当空间频率大于0.5 cpd时，豚鼠已经失去对图形的辨认能力，所以振幅明显降低。但是实验组与对照组的潜伏期随着空间频率的增加差别并不是很明显，原因不明确，还有待研究。

　　在动物视觉功能(视力的评价)的研究上，其研究方法还是比较单一，主要采用行为学的研究方法，这种研究方法不仅时间长，而且变异性比较大，结果不是很统一。比如：Over等[17]报道，6～24 d的鸡的视力，最低值为1.5 cpd;Demello等[18]报道为4～6 cpd。以各种迷宫为基础的行为学研究方法多用于大、小鼠视力的研究。Gianfranceschi等[19]报道转基因小鼠行为学测量视力为0.5～0.6 cpd，Prusky等[20]报道小鼠的视力超过0.5 cpd。另外，行为学方法需要对实验动物进行训练，操作费时，带有一定的主观性，因此探索一种操作方便的、客观的研究方法来解决以上问题是十分有意义的。PVEP与动物的形觉功能密切相关，但是常用的实验动物如大鼠、小鼠难以记录到PVEP，而豚鼠和人眼在组织学以及生理学上有高度的一致性[5]，是一个较好的视觉研究的模型动物[21]。因此，本研究采用PVEP来检测激光对豚鼠视力的影响，虽然其在衡量动物视力的准确性上还有待完善，但是本实验为PVEP检测动物视力的研究提供了一种新方法，用其来研究动物的形觉功能有着重要的意义。

　　总之，本实验初步探讨了680 nm激光对豚鼠PVEP的影响，为进一步研究激光对视觉功能的影响以及PVEP在动物视力的评价提供了实验依据和方法。

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