结膜松弛症泪液黏蛋白及球结膜杯状细胞的研究

　　作者：张兴儒,李青松,项敏泓,蔡瑞霞,俞彰    作者单位：1（200062）中国上海市，上海中医药大学附属普陀医院眼科;2（200032）中国上海市，复旦大学上海医学院电镜室

　　【摘要】 目的：评价结膜松弛症泪液功能及结膜杯状细胞的组织病理学及超微结构改变。方法：结膜松弛症与正常对照组各30例（60眼）进行泪膜破裂时间（tear breakup time,BUT）Schirmer Ⅰ试验、泪液羊齿状试验（tear ferning test,TFT）检查。对10例松弛球结膜组织和10例对照组球结膜对应区组织，采用PAS,AB和HE 染色，对照观察组织病理及超微结构改变。结果：结膜松弛症组BUT（7.72±2.90s）较对照组（14.40±3.68s）减少明显（P＜0.05）。基础Schirmer试验中结膜松弛症组（13.20±4.07mm）较对照组（16.73±4.41mm）明显降低（P＜0.05）。结膜松弛症组泪液中羊齿状结晶明显减少，与对照组间比较差异有显著意义（P＜0.05）。结膜松弛症球结膜上皮中的杯状细胞密度为2.75±2.68/100个上皮细胞，对照组为4.64±3.25/100个上皮细胞，两组间差异无显著性（t=1.42，P=0.172）。随着结膜松弛症程度加重，球结膜杯状细胞密度降低。结膜松弛症球结膜杯状细胞组织形态和超微结构有异常。结论：结膜松弛症泪膜稳定性下降、泪液分泌减少，泪液中黏蛋白减少，结膜杯状细胞数量减少，超微结构有异常。

　　【关键词】  结膜松弛症 Schirmer Ⅰ试验 泪膜破裂时间 泪液羊齿状试验 结膜杯状细胞 组织病理

　　0引言

　　结膜松弛症(conjunctivochalasis)是老年性常见眼病[1]，是由于球结膜过度松弛和/或下睑缘张力高，造成松弛球结膜堆积在眼球与下睑缘、内、外眦部之间形成皱褶，引起眼表泪液学异常，并伴有眼部干涩、异物感、溢泪不适等症状的疾病[2,3]。有研究发现结膜松弛症可引起泪液动力学异常型干眼[4，5]，泪液功能的改变在结膜松弛症的发生与发展中可能起一定的作用。泪膜的稳定性是由脂质层、水液层、黏蛋白层以及泪液动力学等共同维持。结膜杯状细胞主要功能是分泌黏蛋白，黏蛋白是泪膜的重要成分，对稳定泪膜、保护眼表、参与信号转导、维持眼表功能等方面起着重要作用。当各种内、外源性因素引起杯状细胞数量或分泌功能改变时，黏蛋白数量和质量将发生异常。泪液羊齿状试验（tear ferning test，TFT）间接反映了泪液黏蛋白的功能。200710/200810通过对结膜松弛症患者进行泪液功能改变检测和球结膜杯状细胞组织病理学及超微结构观察，探讨结膜松弛症的发病机制。

　　1对象和方法

　　1.1结膜松弛症的病例选择标准[6]

　　选择标准：(1)患者有流泪、干涩、异物感等相关症状之一。(2)裂隙灯显微镜检查球结膜过度松弛成皱褶堆积在眼球与下睑缘、内、外眦部之间，阻碍泪液流向。(3)泪河异常、残缺不完整。(4)观察角膜、泪腺及泪小点正常，无泪小点狭小、闭塞或缺如，冲洗泪道通畅，无引起鼻泪管开口处阻塞的鼻腔病变或异常者，睑缘无内、外翻及倒睫。(5)无影响泪液学异常的其他眼病及全身性疾病，也无眼部手术史，3mo内未应用影响泪液的药物。

　　1.2对照组的病例选择标准[5]

　　选择标准：(1)患者无眼部不适主诉。(2)裂隙灯显微镜检查眼表形态结构无异常。(3)3mo内未应用影响泪液的药物。(4)随机年龄配对单纯白内障手术患者。

　　1.3分组

　　结膜松弛症组：30例（60眼），男12例，女18例，年龄46～79(平均70)岁。按诊断分级标准[7,8]：Ⅰ级15眼，Ⅱ级20眼，Ⅲ级20眼，Ⅳ级5眼。对照组30例（60眼），男女各15例，年龄45～80(平均71)岁。

　　1.4实验材料及仪器

　　裂隙灯显微镜（苏州医疗器械厂）。自吸式毛细玻璃管（中国医药集团上海化学试剂有限公司）。显微镜载玻片（上海机械进出口公司）。泪液检测滤纸条和荧光素钠眼科检测试纸（天津晶明新技术开发有限公司）。Olympus BX51双目光学显微镜。HMIAS2000高清晰度彩色医学图文分析系统（武汉千屏影像技术有限责任公司）。

　　1.5实验方法及检测指标

　　对所有结膜松弛症和对照组患者进行泪液功能评估，采用泪膜破裂时间（tear breakup time，BUT）评估结膜松弛症患者泪膜的稳定性，采用SchirmerⅠ试验评估结膜松弛症患者泪液分泌量的变化，采用泪液羊齿状试验（又称蕨类试验）评估泪液中黏蛋白质含量的变化。所有检查均由同一人完成。

　　1.5.1泪膜破裂时间测定

　　用1滴生理盐水浸润荧光素钠滤纸条，将蘸湿部分轻轻接触受试者的结膜。嘱患者瞬目数次，使荧光素在角膜表面均匀分布。然后让患者自然开大眼睑，同时秒表计时，记录从最后一次瞬目到角膜表面出现第一个黑斑的时间。重复3次，取其平均值计算。

　　1.5.2 SchirmerⅠ试验

　　在同一暗室内进行。检查时间均为每天10∶00～12∶00am，检查前结膜囊内滴入5g/L盐酸丙美卡因滴眼液1滴5min后，将试纸圆头端沿折线处折叠置于患者下睑结膜囊中外1/3处，5min后取出试纸，测量湿长。重复2次，取其平均值计算。

　　1.5.3泪液羊齿状试验

　　检查时间均为每天10∶00～12∶00am，通过10μL的玻璃毛细管在下睑结膜囊泪阜处通过虹吸方法吸取泪液标本（未使用表面麻醉药物或其他化学性药物），尽量不接触眼表。将泪液标本吹入载玻片，在25℃室温下（空调控制温度与湿度）干燥10～20min，置于双目光学显微镜下观察（放大倍数为100×）评级。按照Rolando等[9]的图形分级方法：按泪液羊齿状结晶的完整性、均匀性和分支状态分为4级。Ⅰ级：载玻片上出现均匀、致密的羊齿状分支结晶图，分支间的空间间隔很小。Ⅱ级：出现的羊齿状结晶图的分支数量较少、形态较小，分支间的空间间隔增大。Ⅲ级：结晶图分支明显减少，分支间的空间间隔显著增大，增大的间隔足以形成新的结晶。Ⅳ级：几乎观察不到羊齿状的结晶图，只能看见少量、不定型的结晶。Ⅰ级和Ⅱ级均为正常，Ⅲ级和Ⅳ级为异常。

　　1.6标本收集、处理及制作方法

　　200710/200803在本院结膜松弛症手术治疗的病例中采集10例结膜松弛症病例，男4例，女6例，66～79(平均72.8)岁。按分级标准[79]：Ⅰ级2例，Ⅱ级3例，Ⅲ级4例，Ⅳ级1例。对照组为随机年龄配对在本医院单纯白内障手术患者10例，男4例，女6例，年龄65～80(平均72.2)岁。结膜松弛症患者年龄与对照组年龄差异无显著性（t=0.32，P=0.75）。所有病例球结膜标本均根据告知自愿的原则。手术切除的松弛结膜和对照组切除的对应区域球结膜均采用双眼鼻下方区域：右眼4∶30～5∶30方位；左眼6∶30～7∶30方位，距角膜缘后4mm，标本采集面积2mm×4mm，同一专人操作，标本采集做到同部位、同面积、同方法。病变组和对照组标本完全随机统一编号，每一个标本对于病理医师和电镜师采用盲法观察球结膜杯状细胞的形态数量和超微结构。

　　1.7手术方法

　　按结膜松弛症新月形手术切除方案进行[10，11]，先用5g/L爱尔卡因结膜囊内滴眼3次，每次间隔3min。表面麻醉完成后，开睑器开睑，嘱患者平视，将松弛结膜皱褶向下穹窿部方向推下，使其松弛结膜皱褶位置距角膜缘超过4mm。根据松弛结膜程度用眼显微无齿镊夹提松弛结膜估算手术切除范围，一般宽约3～6mm,使其球结膜平整，切除松弛结膜后用100尼龙线连续缝合结膜。用3×106U/L庆大霉素稀释液冲洗结膜囊，涂3mg/g泰利必妥眼膏包眼。术后1d术眼开始用4.2×106U/L贝复舒滴眼液和3g/L氧氟沙星滴眼液1wk;7d后拆线。

　　1.8组织病理学标本

　　采集的标本立即用40g/L甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，5μm切片，用PAS（peviodic acid Schiff）染色和AB(Alcian blue)染色显示杯状细胞。电镜标本：采集的标本用25g/L戊二醛（0.1mol/L磷酸缓冲液配制，pH 7.2）保存固定后，样本切成<1mm的3小块，10g/L PSO4（0.1mol/L磷酸缓冲液配制，pH 7.2）后固定2h。梯度乙醇脱水，618环氧树脂包埋。超薄切片经铀—铅染色后在JEM—1200EX透射电镜下观察。    　　统计学分析：采用SPSS 12.0统计软件包对数据进行统计学分析。数据用均值±标准差(±s)表示，两组间比较采用t检验，结膜松弛症组和对照组泪液羊齿状试验比较，采用率或构成比差异的卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1 BUT测定

　　结膜松弛症组的BUT值7.72±2.90s，与对照组BUT值(14.40±3.68s)比较，差异有统计学意义（t=11.05，P＜0.01）。

　　2.2 SchirmerⅠ试验测定

　　SchirmerⅠ试验中结膜松弛症组（13.20±4.07mm）与对照组（16.73±4.41mm）比较，差异有统计学意义（t=4.56，P＜0.01）。说明结膜松弛症存在泪液分泌量的减少。

　　2.3 TFT测定

　　结膜松弛症组60眼的泪液中羊齿状结晶：Ⅰ级9眼(15%)，Ⅱ级14眼(38%)，Ⅲ级34眼(57%)，Ⅳ级3眼(5%)。而对照组60眼的泪液中羊齿状结晶：Ⅰ级24眼(40%)，Ⅱ级33眼(55%)，Ⅲ级3眼，仅占到5%（3/60），未发现Ⅳ级表现。结膜松弛症组与对照组比较，结膜松弛症组患眼泪液中羊齿状结晶明显减少，差异有统计学意义（DF=3，P=0.001，表1）。随着结膜松弛症病程的加重，泪液中羊齿状结晶明显减少，差异有显著意义（DF=9，P=0.001）（表1，图14）。结膜松弛症Ⅰ级15眼中14眼（93%）为正常（Ⅰ级和Ⅱ级），1眼(7%)为异常（Ⅲ级）。结膜松弛症Ⅱ级20眼中7眼(35%)为正常（Ⅰ级和Ⅱ级），13眼(65%)为异常（Ⅲ级）。结膜松弛症Ⅲ级20眼中2眼(10%)为正常（Ⅱ级），18眼(90%)为异常（Ⅲ级和Ⅳ级）。结膜松弛症Ⅳ级5眼均为异常，其中Ⅲ级3眼（60%），Ⅳ级2眼（40%）。表1TFT的分级比例比较n(略)

　　2.4球结膜杯状细胞形态结构

　　结膜松弛症组：球结膜鳞状上皮厚薄不均，为4～15层，一般为4～7层。上皮层中杯状细胞多少不一，大小形态相似，各层均都有杯状细胞，在100个上皮细胞内杯状细胞约为2.75%。形态类似脂肪细胞，体积较大，随上皮细胞基底层向表层迁移，细胞形态逐渐变化，底层细胞呈圆形，表层细胞呈椭圆形。细胞核扁平，偏于细胞底部，核染色质细匀，胞质饱满，含有大量黏液，AB染色杯状细胞呈蓝色（图5），PAS染色杯状细胞呈红色（图6）。另见少数基底细胞色素沉着，固有层结缔组织疏松、很薄，血管扩张瘀血，少数淋巴细胞灶性浸润。正常对照组：球结膜上皮较薄，为4～5层。上皮层中杯状细胞多少不一，形态与结膜松弛症组相似，在100个上皮细胞内杯状细胞约为4.64%（图7）。

　　2.5球结膜杯状细胞数量比较

　　结膜松弛症组和正常对照组各10例鼻下方球结膜上皮中的杯状细胞密度。在200倍视野下计算在100个上皮细胞内杯状细胞的数量，分别3次计算不同视野100个上皮细胞内杯状细胞的数量，其平均密度为：结膜松弛症组为2.75±2.68/100个上皮细胞（图5），对照组为4.64±3.25/100个上皮细胞（图6），但是两组间统计学检验差异无显著性（t=1.42，P=0.172）。将结膜松弛症按临床分级为Ⅰ～Ⅳ级，共4组，分别观察不同程度结膜松弛症上皮细胞中杯状细胞的密度，在100个上皮细胞内杯状细胞的平均密度为：Ⅰ级3.9%，Ⅱ级2.96%，Ⅲ级2.05%，Ⅳ级1.33%。发现结膜松弛症程度愈重，杯状细胞密度愈低。            

　　2.6球结膜杯状细胞超微结构电镜观察

　　结膜松弛症组：电镜观察结膜松弛症鼻下方球结膜上皮中的杯状细胞，可见杯状细胞顶面胞质内大量浆液性分泌颗粒堆积，颗粒不规则形，内含条纹样物，直径0.6～1.3μm。细胞基底面富含粗面内质网，有少量线粒体，细胞核因挤压常偏于一侧（图8）。正常对照组：电镜观察正常对照组鼻下方球结膜上皮中的杯状细胞，可见杯状细胞胞质中充满高电子密度、大小不等的黏液小滴；含有丰富的粗面内质网；线粒体较为丰富；靠近细胞核上部有一个大的高尔基体；大量由膜包围的黏液（黏蛋白）小滴，可聚合成为巨大的顶端团块；细胞顶端有微绒毛。

　　3讨论

　　结膜松弛症的发生与年龄相关，出现了球结膜、泪液和睑缘三者平衡的失调，眼表的自动反馈调节系统失调，出现了眼表泪液学动力失衡为先，静力失衡为主的变化。球结膜组织发生以弹力纤维减少为主要的病理改变后[12，13]，泪液中出现蛋白质及酶的异常表达[6]，在瞬目或闭眼时下睑张力没有减弱仍然向上推压已经过度变薄、弹性下降、张力降低、与其下方组织结合疏松的球结膜，松弛结膜就会明显堆积在下睑缘上、内、外眦部之间，形成皱褶，突出于眼表曲面，影响泪液的流动、分布、排泄，在松弛结膜上不能形成正常泪膜，而发生干燥、充血、水肿、上皮角化、泪河变窄或残缺不全，泪液不能正常流动到泪湖区，泪湖不能聚泪，泪液不能进入泪点，使泪液排泄出现障碍[14]。泪液清除延缓又可导致大量降解酶的堆积，炎性因子增加，结膜成纤维细胞中基质蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）中MMP1及MMP3过度表达[15，16]，可能使胶原纤维溶解，弹力纤维变性，引起眼表泪液异常的病理循环，而发生结膜松弛症[2]。泪膜的稳定性是由脂质层、水液层、黏蛋白层以及泪液动力学等共同维持，结膜松弛症组BUT的下降可能与泪液的成份异常和泪液动力学异常有关。结膜松弛症患者泪液分泌减少与对照组比较，差异有统计学意义。结膜松弛症患者松弛结膜堆积在下睑缘上、内、外眦部之间，形成皱褶，影响泪液的流动、分布、排泄。堆积在下睑缘的松弛结膜影响泪河形成和睑板腺口脂质分泌，使泪膜形成异常。另外，在瞬目时，由于松弛结膜使上睑缘不能正常接触到下睑缘，不能将黏蛋白正常运输到眼表，可能影响黏蛋白在眼表的分布，引起泪膜的不稳定，使BUT下降。BUT结果主要取决于泪黏蛋白和水液层，BUT和TFT试验都间接反映了泪液黏蛋白的功能异常。Maragou等[17]提出泪液羊齿状结晶试验检测可作为KCS的诊断方法，Golding等[18]在对泪液羊齿状结晶的显微摄像研究中指出，泪液中盐类和高分子物质包括蛋白和黏蛋白是影响泪液羊齿状结晶的决定因素，并应用X线和扫描电镜分析正常泪液羊齿状结晶时发现，泪液羊齿状结晶主要由NaCl,KCl及一些微量离子组成，黏蛋白和高分子蛋白则包裹在结晶表面，间接控制结晶形成，这进一步证实黏蛋白和盐分子的比例是决定泪液羊齿状结晶多少的重要因素[18]。本研究30例60眼结膜松弛症泪液中羊齿状结晶明显减少与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），随着结膜松弛症病程的加重，泪液中羊齿状结晶明显减少，差异有显著意义（P＜0.05）。Ⅰ级结膜松弛症羊齿状结晶正常（Ⅰ级和Ⅱ级）占93%，Ⅱ级结膜松弛症羊齿状结晶正常（Ⅰ级和Ⅱ级）占35%，Ⅲ级结膜松弛症羊齿状结晶正常（Ⅱ级）仅占10%，Ⅳ级结膜松弛症5眼均为异常，其中Ⅲ级占60%，Ⅳ级40%。说明结膜松弛症患者泪液中黏蛋白减少。结膜杯状细胞为单核细胞黏液腺，来源于结膜上皮细胞最底层的圆柱状细胞。主要集中于睑结膜和穹窿部结膜；下穹窿鼻侧和半月皱襞处最多，球结膜的颞侧分布最少，而近睑缘部及角膜缘部的结膜则缺如。在正常情况下，结膜上皮杯状细胞的数量比较恒定，一般不受外界气候及环境变化的影响。在青壮年期，其绝对数量达到最高峰，在35岁左右，数量逐渐减少至稳定水平；老年人则由于杯状细胞随年龄老化而逐渐萎缩，故其数量显著减少。我们采集的结膜组织为鼻下方区域，所有样本均采用同部位、同面积、同方法、同一人操作，以减少误差。同时在检测中实行标本统一编号，盲法检查，使数据可信。结膜松弛症组球结膜上皮细胞内杯状细胞的平均密度（2.75±2.68/100个上皮细胞）较对照组（4.64±3.25/100个上皮细胞）少，随着结膜松弛症临床分级加重杯状细胞的密度进一步减少，这也符合结膜松弛症泪液中黏蛋白减少的结果。球结膜杯状细胞减少，泪液中黏蛋白量就减少，泪膜的质量就下降，泪膜的功能就受到影响。同时结膜松弛症球结膜杯状细胞超微结构也有异常。结膜松弛症组杯状细胞顶面胞质内大量浆液性分泌颗粒堆积，细胞基底面富含粗面内质网，线粒体少。而正常对照组球结膜杯状细胞有丰富的粗面内质网，大量的线粒体；有一个大的高尔基体；大量由膜包围的黏液（黏蛋白）小滴，细胞顶端有微绒毛。二者超微结构方面也有一定差异。泪膜的稳定性是由脂质层、水液层、黏蛋白层以及泪液动力学等共同维持，结膜杯状细胞其主要功能是分泌黏蛋白，黏蛋白是泪膜最内层的主要成分，有稳定泪膜、抗感染、润滑眼表、维持光滑的屈光界面等生理作用，对维持眼表功能起重要作用。当球结膜杯状细胞数量或/和功能异常时，泪液中的黏蛋白的分泌就会出现异常，使得泪膜的结构和功能发生异常，泪膜稳定性下降，可使眼表组织受损，出现眼表泪液学异常，导致眼部不适和视力下降等症状。    　　本研究显示结膜松弛症患者泪液分泌减少，泪膜稳定性下降，泪液中羊齿状结晶减少，间接反映了泪液中黏蛋白减少。球结膜杯状细胞随结膜松弛症加重而减少，并有形态及超微结构异常表现，这些可能是导致结膜松弛症的发生发展的重要原因。

【参考文献】  　1 Mimura T, Yamagami S, Usui T, et al. Changes of conjunctivochalasis with age in a hospitalbased study. Am J Ophthalmol2009;147(1):171177

　　2张兴儒，李青松，许琰,等.结膜松弛症.中华眼科杂志2008;44（10）：583

　　3严雅静,张兴儒,项敏泓,等.结膜松驰症下睑缘位置及张力观察.国际眼科杂志2009;9(3):495497

　　4刘祖国.关于干眼名词及分类的初步建议. 中国眼耳鼻喉科杂志2004;4(1):45

　　5 Di Pascuale MA, Espana EM, Kawakita T, et al. Clinical characteristics of conjunctivochalasis with or without aqueous tear deficiency. Br J Ophthalmol2004;88(3):388392

　　6 Zhang XR, Xiang MH, Wu QQ, et al. The tear protemics analysis of conjunctivochalasis. Spekstrum Augenheilked2008;22(5):288294

　　7 Hh H, Schirra F, Kienecker C, et al. Lidparrallele konjunktivale falten (LIPCOF) sind ein sicheres diagnostisches zeichen des trockenen auges. Ophthalmologe1995;92(6):802808

　　8张兴儒，李青松，许琰,等.眼结膜松弛的临床分级探讨.眼科2001;10(6):361

　　9 Rolando M, Baldi F, Calabria G. Tear mucus crystallinzation in children with cystic fibrosis. Ophthalmologica1988;197(2):202206

　　10 Jordan DR, Pelletier CR. Conjunctivochalaisis. Can J Ophthalmol 1996;31(4):192193

　　11 Liu D.Conjunctivochalasis. A cause of tearing and its management. Ophthalmic Plast Reconstr Surg1986;2(1):2528

　　12张兴儒，蔡瑞霞，王宝华，等.结膜松弛症的组织病理学观察.中华眼科杂志2004;40（1）：3739

　　13 Meller D, Tseng SC.Conjuctivochalasis:literature review and possible pathophysiology. Sure of Ophthalmol1998;43(3):225232

　　14李青松,杨振燕，张兴儒,等.结膜松弛症泪液排泄系统～(99m) TcSPECT动态显像的临床研究.同济大学学报2006;27(4):5660

　　15 Li DQ, Meller D, Liu YQ, et al. Overexpression of MMP1 and MMP3 by cultured conjunctivochalasis fibroblast. Invest Ophthalmol Vis Sci2000;41(2):404410

　　16 Meller D, Li DQ, Tseng SC. Regulation of collagenase, stromelysin, and gelatinase B in human conjunctival and conjunctivochalasis fibroblasts by interleukin1beta by and tumor necrosis factoralpha. Invest Ophthalmol Vis Sci2000;41(10):29222929

　　17 Maragou M, Vaikousis E, Ntre A, et al. Tear and saliva ferning tests in Sjogrens syndrome (SS). Clin Rheumatol1996;15(2):125132

　　18 Golding TR, Baker AT, Rechberger J, et al. Xray and scanning electron microscopic analysis of the structural composition of tear ferns. Cornea 1994;13(1):5866