角膜移植免疫耐受的研究进展
发表时间：2009-06-30 浏览次数：648次
作者：马骁,黄一飞
【摘要】 排斥反应是角膜移植失败的主要原因。临床治疗中常用的非特异性免疫抑制剂，如糖皮质激素、环孢素A等，存在着许多全身副作用。因此诱导受体建立针对供体角膜的特异性免疫耐受是治疗排斥反应的理想方法。免疫耐受的机制主要包括T细胞克隆失活（anergy）、克隆清除(delete)、细胞因子介导的抑制及免疫平衡等。现就目前人工诱导免疫耐受的方法作一综述。
【关键词】 角膜移植 免疫耐受
Advancement of corneal transplantation immune tolerance
Xiao Ma, Yi-Fei Huang
Foundation item: National Natural Science Foundation of China（No.30471855）
Department of Ophthalmology, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China
AbstractCorneal transplantation is one of the most successful forms of organ transplantation in humans. However, immunologic rejection continues to be a common cause of graft failure. To obtain the long term survival of corneal grafts, especially in high risk recipients, systemic immunosuppression such as cyclosporine A and dexamethasone are usually used in clinic. But these drugs have many undesirable side effects. So, it is necessary to search novel immunosuppression to induce antigen-specific tolerance. The immune tolerance mechanism includes the induction of specific T cell anergy, delete or immunoregulation.
· KEYWORDS: corneal transplantation; immune tolerance
0 引言
排斥反应是角膜移植失败的主要原因[1,2]。现临床中常用的治疗药物如糖皮质激素、环孢素A等均为非特异性免疫抑制剂，同时抑制CD4+T和CD8+T细胞，长期使用增加癌和感染的发生率。因此诱导受体产生针对供体角膜的特异性免疫耐受是解决排斥反应、短期用药即可使移植物长期存活的理想方法。免疫耐受的机制主要为T细胞克隆失活（anergy）、克隆清除(delete)、细胞因子介导的抑制及免疫平衡等。现就目前人工诱导免疫耐受的方法作一综述。
1阻断共刺激通路诱导免疫耐受
角膜移植排斥反应主要是由T淋巴细胞介导的迟发型超敏反应， CD4+T细胞是主要的效应细胞，其激活需要两种信号刺激，第一信号为特异性抗原识别信号，即CD4+T细胞表面的TCR-CD3复合体与抗原递呈细胞（APC）的抗原多肽-MHCⅡ类分子复合体结合，第二信号为共刺激信号，即APC表面黏附分子与CD4+Ｔ细胞表面相应配体结合。如只有第一信号，缺乏共刺激信号的协同作用，接受抗原刺激的CD4+Ｔ细胞不能有效活化，而处于特异性无反应状态（克隆失活），表现为免疫耐受。目前认为最重要的共刺激途径是B7-CD28/CTLA-4和CD40-CD154。
1.1 B7-CD28/CTLA-4共刺激途径 CD28与CTLA-4是一对正负调节性共刺激分子，各表达于100%的活化CD4+Ｔ细胞表面及活化24h后的CD4+Ｔ细胞表面，竞争与APC表面的B7（CD80,CD86）分子结合。CD28与B7结合可导致CD4+Ｔ细胞扩增、IL-2分泌、细胞周期蛋白表达上升、CD154表达上调；而CTLA-4与B7结合减少IL-2R表达及IL-2分泌，将Ｔ细胞阻滞于G1期抑制其激活[3]。这一正负调节途径对于免疫动态平衡很重要。利用CTLA-4-B7负性共刺激信号及其竞争性阻断CD28-B7正性共刺激信号途径的作用，可诱导同种移植物的免疫耐受。CTLA-4Ig是由CTLA-4的细胞外功能区与人IgG1FC段融合形成的可溶性重组融合蛋白,是CTLA-4的功能性替代物。Comer等[4]在鼠角膜移植排斥模型中发现：无论是术前使用CTLA-4Ig浸泡供体还是术后使用CTLA-4Ig治疗受体，移植的角膜存活时间均明显延长。大量动物实验表明角膜移植术后，供受体接合区域有大量CD80（B7-1）及CD86（B7-2）的表达，联合应用抗CD80及抗CD86单克隆抗体，通过阻断CD28与B7结合可诱导免疫耐受，延长角膜同种异体移植物的存活时间[5]。
1.2CD40-CD154共刺激途径 特异性抗原识别信号可在4h后刺激T细胞表面表达CD154[6]，CD154与静止的APC表面的CD40结合，提供直接共刺激信号活化APC，诱导其表达B7分子，B7再与CD4+T细胞表面的CD28结合，提供间接共刺激信号活化CD4+T细胞。此过程中，CD40/CD28构成了正性信号循环[7]。因此阻断CD40-CD154共刺激途径，将减少APC表达B7，使T细胞缺乏共刺激而进入克隆失活。Qian等[8,9]在鼠角膜移植模型中发现：结膜下或腹腔内注射抗CD154单克隆抗体可预防无血管化的角膜发生移植排斥反应、延迟血管化的高危角膜出现排斥反应的时间、抑制Th1产生IFN-γ。
但研究中也发现,任何单抗的单独应用,均不能获得长期稳定的免疫耐受，为解决这一问题，Safley等[10]在将猪胰岛移植给鼠的实验中，使用CTLA-4Ig和抗CD154单克隆抗体联合阻断B7-CD28/CD40-CD154共刺激途径，协同诱导免疫耐受，使移植物获得了长期存活。但这一结果在鼠角膜移植模型中并未得到支持，Ardjomand等[11]发现无论是单独还是联合使用CTLA-4Ig和抗CD154单克隆抗体，角膜移植物的存活时间都无明显差别，而且对于CD28基因敲除的小鼠，术后加用抗CD154单克隆抗体治疗后，角膜移植物的存活时间也未见延长。因此CD28和CD154共刺激途径的关系及其联合被阻断时是否可协同诱导免疫耐受需进一步探讨。
目前，阻断一种或两种共刺激途径，同时联合应用单抗（如抗CD25单抗、抗IL-2R单抗、抗LFA-1单抗等）来诱导长期稳定的免疫耐受，已相继在鼠的皮肤及心脏移植实验中获得成功[12,13]，但在角膜移植中尚未见报道。ICOS-ICOSL是CD28-B7家族的另一重要成员，在T细胞的活化中发挥重要作用，Guillonneau等[14]在鼠心脏移植模型中发现，单独使用抗ICOS单克隆抗体或联合应用CD40抗原可延长移植物的存活时间并抑制晚期免疫排斥反应的发生、诱导长期免疫耐受，其机制可能是慢性排斥反应依赖ICOS-ICOSL而非CD40-CD40L来实现的。现在还发现另一种重要的共刺激信号CD134-CD134L，它在移植排斥反应中可协同CD28-B7调节T细胞功能，联合阻断时有助于诱导长期免疫耐受[15]，但其具体调节机制还不清楚，有待进一步研究。
2 Fas/FasL介导细胞凋亡诱导免疫耐受
角膜能成为免疫赦免器官，Fas/FasL介导的细胞凋亡在其中发挥重要的作用。最初，我们多是在CTL细胞的非分泌型杀伤机制中认识到Fas/FasL：FasL表达在Ｔ细胞表面，Fas表达在靶细胞表面，二者结合后诱导靶细胞分子胞内段启动致死信号，使靶细胞在基因控制下发生主动性程序性死亡（细胞凋亡）。但是在机体中，还有这样一部分活化的T细胞，其表面表达Fas，而角膜内皮和上皮细胞表面表达FasL（眼前房内还可检测到sFasL），使进入角膜内的活化的T细胞凋亡,而角膜细胞本身免于杀伤。在角膜移植术后，角膜内皮和上皮细胞表面的FasL表达无下调[16]、房水中sFasL的含量增加（尤其在角膜排斥反应来临之前增加更明显）[17]，这些均有助于角膜成为免疫豁免区。
利用Fas/FasL介导细胞凋亡这一机制，可通过诱导移植物高表达FasL形成免疫耐受而延长移植物的存活期。动物实验已证实，通过腺病毒载体将FasL cDNA基因转导入鼠的肾脏、胰岛、角膜移植物中，使其表达FasL，可保护移植物不被受体免疫系统排斥，延长其存活时间。但研究中也发现,当FasL过度表达于供体角膜表面时，可导致供体角膜内大量多形核白细胞浸润，反而加速了移植的失败[18],这可能还与表达Fas的角膜细胞自身相互作用并发生破坏有关。故对Fas/FasL通路调控凋亡的应用还需进一步研究。
3克隆清除或使T细胞衰竭诱导免疫耐受
3.1克隆清除 可分为中央型清除和周围型清除。角膜移植免疫耐受中很少使用中央型清除（胸腺清除），多为周围型清除，即在移植期间使用全T细胞免疫毒素或其它清除抗体（如抗CD3、抗CD4、抗CD8单克隆抗体）清除循环中的成熟T细胞，在移植物植入时淋巴细胞活化、增殖最强烈的时候阻止免疫反应，使移植物和免疫系统在移植后更为静止的时期“相遇”，导致免疫应答的转化，结合其它克隆失活机制进入免疫耐受,Pindjakova等[19]在鼠异种角膜移植模型中，使用抗CD4单抗处理受体，结果减少了细胞因子IL-2，IL-4，IL-10的产生，显著延长了移植物的存活。
3.2诱导T细胞衰竭 过强的免疫应答可使特异识别该抗原的淋巴细胞库枯竭。超抗原即可引起这种现象，其在极低浓度即可比普通抗原高数十倍至数千倍的过度刺激T细胞，活化的T细胞大量被清除，导致T细胞功能和数量失调，继发免疫抑制状态。超抗原还能抑制CD4+CD25+调节T细胞的活性、抑制效应T细胞的增殖，但具体机制不清[20]。接英等[21]在大鼠高危角膜移植模型中，术前给予受体大鼠腹腔内注射超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B亚单位（SEB），结果角膜植片及外周免疫器官中的CD4+和CD8+T细胞数目均明显减少、促进细胞增殖的IL-2因子减少而抑制性细胞因子IL-10增加，受体淋巴细胞免疫耐受形成，角膜植片存活时间明显延长。
4诱导受体产生免疫偏离
CD4+Ｔ细胞根据其分泌细胞因子的不同可分为Th1和Th2两类亚群。Th1细胞分泌IL-2，TNF，IFN-γ，介导细胞免疫；Th2细胞分泌IL-4，5，6，10，13，辅助B细胞增殖及抗体生成。正常状态下,Th1和Th2细胞功能处于动态平衡之中。在同种异体移植时,Th1启动迟发型超敏反应,是角膜植片中主要的浸润细胞[22]；Th2通过分泌的细胞因子抑制Th1活性,而促使免疫耐受的形成[23]。因此促进宿主Th1型应答向Th2型应答转换是诱导移植耐受的另一策略，有报道，APC内的巯基氧化还原剂具有调节Th1/Th2平衡的作用，Yamada等[24]向受体鼠腹腔内注射药物诱导巨噬细胞内产生谷胱甘肽，延长了角膜植片的存活时间，其可能机制为巨噬细胞内的谷胱甘肽抑制了Th1的免疫应答。Sonoda等[25]先预先将供体鼠C57BL/6的角膜组织植入受体BALB/c鼠的前房内，然后再行角膜移植手术，结果角膜植片的存活期延长，这是因为植入受体前房内的供体组织诱导了受体前房相关免疫偏离（ACAID）。诱导移植耐受还可以通过阻断Th1细胞分泌的细胞因子或增强Th2细胞分泌的细胞因子的效应来实现。IL-10是巨噬细胞的强抑制剂,并可抑制Thｌ型淋巴因子的产生,成为这一策略的首选细胞因子。EBV编码的病毒IL-10(ＶIL-10)与人和鼠的IL-10有高度同源性,具有人和鼠IL-10的多种相同的生理功能。用编码ｖIL-10的逆转录病毒转入移植心脏,可延长同种心脏移植的存活期达44 d,且表现出一定的剂量依赖关系[26]。Klebe等[27]在羊角膜移植模型中，体外转染编码IL-10的基因给供体角膜，也成功诱导了免疫耐受，延长了移植物的存活。
5基因工程技术诱导免疫耐受
基因治疗诱导免疫耐受有其独特优势：（1）可于移植前在体外预处理移植物，减低其毒性、免疫原性，减少载体在体内表达的可能性。（2）瞬时的目的基因表达即可改变受体的免疫状态。目前常用的载体有复制缺陷的腺病毒载体，用于基因治疗的靶分子主要有辅助分子/黏附分子、细胞因子、FasL等，并且在角膜移植模型中已有CTLA-4Ig cDNA[4]、IL-10基因[27]、FasL cDNA基因转导成功诱导免疫耐受的报道。但因为目的基因的表达效率及受体对表达基因产物的排斥反应等问题还未得到解决，限制了基因治疗的临床应用。
T细胞群中有一免疫抑制细胞亚群的存在，如CD4+CD25+T调节性细胞亚群，可抑制T细胞的活化而诱导免疫耐受，目前已有动物实验研究增强调节性T细胞的功能和数量来治疗自身免疫病和抑制移植排斥反应。目前其它器官移植实验中，有利用口服抗原、应用抑制性树突细胞诱导免疫耐受的报道。但在角膜移植中，这些方法鲜有应用。
诱导免疫耐受治疗角膜移植排斥在动物实验中已经取得了一定成果，目前的问题是如何诱导稳定持久的免疫耐受及确定已形成的免疫耐受，这是以后研究的方向。
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