ＮＦ-κＢ活性对TNF-α调节小梁细胞表达MMP-3和MMP-9的影响

作者：吴瑜瑜

 作者单位：福建医科大学第二临床医学院 眼科，福建 泉州 362000 【摘要】  目的 探讨核因子-κB（nuclear factor-κＢ，ＮＦ-κＢ）是否参与肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）调节人眼小梁细胞（human trabecular cells，HTCs）表达基质金属蛋白酶－3（matrix metalloproteinases－3，MMP-3）和基质金属蛋白酶－9（matrix metalloproteinases－9，MMP-9）的过程。方法 采用 RT-PCR法和酶谱分析法（zymography）检测体外培养的人眼小梁细胞经0 ng/ml（对照组）、1 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml TNF-α处理24 h后，细胞表达MMP-3、MMP-9的量；运用ＮＦ-κＢ的特异抑制剂二硫氨基甲酸吡啶（pyrrolidine dithocarba-mate，PDTC）抑制ＮＦ-κＢ的活化，观察TNF-α对体外培养的HTCs MMP-3，MMP-9表达影响的改变。结果 运用RT-PCR法和酶谱分析法研究均发现经浓度为1 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml的TNF-α处理的细胞在mRNA和上清液中活性蛋白水平均能增加MMP-3、MMP-9的表达，各组mRNA/β-actin吸光度比值和条带酶解量与对照组相比差异均有显著性（P<0.05）。提前30 min加入PDTC，MMP-3、MMP-9的表达量分别较未加入PDTC组表达量明显减少，差异有显著性（P<0.05）。结论 TNF-α可上调MMP-3及MMP-9的表达，PDTC能够下调TNF-α对小梁细胞MMP-3及MMP-9的表达，因此推测ＮＦ-κＢ可能参与MMP-3和 MMP-9转录的启动。 【关键词】  细胞培养 小梁细胞 肿瘤坏死因子-α 基质金属蛋白酶 核因子-κB   原发性开角型青光眼（primary open-angle glaucoma，POAG）是一种慢性进行性前部视神经病变，伴有典型的视神经凹陷、萎缩及视野缺损，房角是开放的。然而迄今为止，其病因及发病机制尚不清楚。许多研究发现POAG患者小梁网中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）异常堆积，房水流出阻力增加。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一类金属依赖性的蛋白水解酶家族，是降解细胞外基质主要的酶。激光小梁成形术（laser trabeculoplasty，LTP）是治疗POAG的一种有效的方法，术后发现房水的流出率增加，同时房水中的肿瘤坏死因子-α（tumor necrotil factor-α，TNF-α）分泌增加，推测两者之间存在相关性，即激光小梁成形术可能通过诱导增加细胞因子TNF-α分泌来增加小梁的MMPs家族，尤其是MMP-3及MMP-9的表达。核因子-κＢ（nuclera facotr-κＢ，ＮＦ-κＢ）是一种可快速对外界刺激做出反应的核转录因子，被激活后结合至DNA相应的位点，调节下游靶基因的转录表达，它可被多种物质激活，如TNF-α。故本实验采用RT-PCR法和酶谱分析法（zymography）观察不同浓度TNF-α对体外培养的人眼小梁细胞（human trabecular cells，HTCs）MMP-3和MMP-9表达的影响，并运用ＮＦ-κＢ的特异抑制剂二硫氨基甲酸吡啶（pyrrolidine dithocarba-mate，PDTC）抑制ＮＦ-κＢ的活化，观察抑制后TNF-α对小梁细胞MMP-3和MMP-9表达影响的改变，并探讨这种改变的机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  眼球  来源于意外死亡的健康成年人眼球组织，均经家属自愿签署知情同意书后取材，供体年龄在25~45岁之间，共7只，死亡后24 h内取材。

1.1.2  主要试剂  DMEM/F12培养液，胰蛋白酶（Gibco公司），Hank’s液（Hyclone公司），胎牛血清（华美公司），重组人TNF-α、标准MMP-3、MMP-9（R&D公司），鼠抗人纤维连接蛋白单克隆抗体（anti-FN），鼠抗人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体（anti-NSE）（北京中山生物技术有限公司），鼠抗人层黏连蛋白单克隆抗体（anti-LN）， SP试剂盒，AEC Kit（福州迈新生物技术开发公司），Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司），氯仿，异丙醇，无水乙醇，DEPC处理水（上海化学试剂有限公司），逆转录试剂盒（Fermentas公司），PCR试剂盒（上海博亚生物技术有限公司），PCR Mark （CASARRAY），明胶、酪蛋白、PDTC（Sigma公司），40%丙烯酰胺、Tris、SDS、过硫酸铵、TritonX-100、甘氨酸、叠氮钠、CaCl2·2H2O、ZnCl2、溴酚蓝、考马斯亮蓝G-250、甲醇、冰乙酸、甘油（上海生物技术开发公司）、TEMED（Amreso公司）。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养及鉴定  人眼小梁细胞（human trabecular cells，HTCs）的体外培养采取组织块法[1-3]。应用解剖显微镜于无菌条件下，沿角膜緣后3~5 mm处环形剪开，去掉后节，前节倒置于无菌台上。在解剖显微镜下把自制的细铜丝插入Schlemm氏管，仔细分离小梁网，剪成2 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，放入25 ml培养瓶底中，贴壁30 min后加入含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于含5% CO2、100%湿度、37℃ 恒温培养箱中培养。当细胞融合后用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化传代培养。于光镜、倒置显微镜、透射电镜下观察，并进行纤维连结蛋白（fibronectin，FN）、层黏连蛋白（laminin，LN）、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）免疫组化染色。另将消化后的细胞离心后弃上清，加入2.5%戊二醛-2%多聚甲醛混合液固定，送电镜室常规透射电镜标本制备，观察细胞超微结构并摄片。

    1.2.2  实验分组  取第3代HTCs以5×104/ml的浓度接种于6孔板中，待细胞融合后，无血清培养   48 h后，随机分为6组：1~4组施加TNF-α终浓度分别为0（对照组）、1 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml的培养液（不含血清），第5，6孔以100 ?滋mol/L的（PDTC）预处理30 min后，分别于TNF-α终浓度为10 ng/ml、25 ng/ml的培养液（不含血清）中培养， 均培养24 min后进行下一步的RT-PCR。另收获细胞培养上清液，记录细胞数，于离心半径4.5 cm，2000 r/min离心10 min，提取上清液，于-70℃冰箱保存，进行酶谱实验。

    1.2.3  RNA提取  取上述培养的HTCs，按试剂盒说明书采取Trizol一步法提取总RNA，经含溴化乙啶的甲醛琼脂糖凝胶电泳，紫外光透射下可见清晰完整的18S和28S条带，经紫外线分光光度计检测纯度（OD260/OD280）在1.8以上，各组取总RNA 2 ?滋g，加OligodT18primer（0.5 ?滋g/?滋l） 1 ?滋l加DEPC-treated water至12 ?滋l，混匀轻离心后70℃水浴孵育5 min，立即置于冰上。加入5×reation Buffer 4 ?滋l，10 mM dNTP 2 ?滋l，RibolockTM Ribonuclease inhibitor （20 U/?滋l） 1?滋l，混匀轻离后37℃水浴孵育5 min。加入RevertAid TM M-MuLV Reverse Transcriptase （200 U/?滋l） 1?滋l，混匀轻离后42℃水浴孵育60 min。70℃水浴10 min终止反应，合成的cDNA置于-20℃保存备用。

    1.2.4  逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）  各取   2 ?滋l cDNA进行PCR扩增。MMP-3引物合成参照Li等[2]的报道，MMP-9和β-actin引物应用primer5.0软件自行设计，上述引物均由博亚生物制品有限公司合成。MMP-3引物的序列上游为5′-CCTGCTTTGTCCTTTGATGC-3′，下游为5′- TGAGTCAATCCCTGGAAAGTC-3′，片断长度432 bp；MMP-9引物的序列上游为5′-GGGACGGCAATGCTGAT-3′，下游为5′-CGCCACGAGGAACAAACT-3′，片断长度362 bp；选取β-actin作为内对照，β-actin引物的序列上游为5′-CTATTGGCAACGAGCGGTTC-3′，下游为5′-CTTAGGAGTGGGGGTGGCTT-3′。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，退火温度不同引物各有不同（MMP-3退火温度为55℃，MMP-9为60℃，β-actin为58℃）1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸10 min。分别取5 ?滋l扩增产物（MMP-3，MMP-9）与β-actin扩增产物混合上样，加Maker 3?滋l，在含有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳， 经凝胶电泳图像分析仪拍照，并分析电泳条带的相对灰度值，计算出目的基因的mRNA水平的相对表达量。所有实验均重复3次，所得数据均采用均数±标准差表示。

1.2.5  酶谱分析（zymography）法[3-4]  用分别含有酪蛋白和明胶的SDS-PAGE检测MMP-3和MMP-9的活性。分离胶浓度为8%（含0.2%酪蛋白或明胶），浓缩胶为5%，根据各处理组细胞数调节培养上清液的上样量。同时加入标准MMP-3和MMP-9作为标准对照。SDS-PAGE电泳结束后，凝胶连续振荡于2.5%Triton X-100溶液中以除去SDS。将凝胶置于反应液（50 mmol/L Tris，10 mmol/L CaCl2，200 mmol/L NaCl，1 ?滋mol/L ZnCl2，pH值为7.5）中37℃孵育24 h，0.1%考马斯亮蓝染色液染色2 h，脱色液脱色至蓝色背景下白色条带清晰。此凝胶经凝胶成像分析系统分析读取条带面积和灰度。条带酶解量=条带面积×（条带灰度-背景灰度），以反映酶的含量。

    1.2.6  统计学方法  以上实验重复3次。所有数据均以均数±标准差形式表示，采用SPSS for Windows11.0软件进行Levene方差齐性检验，单因素六水平设计定量资料的方差分析，LSD两两组间多重比较各组间差异的显著性。单因素六水平设计定量资料的方差分析，LSD两两组间多重比较各组间差异的显著性。

    2  结果

    2.1  ＮＦ-κＢ在TNF-α对小梁细胞MMP-3及MMP-9表达影响中的作用

    2.1.1  RT-PCR结果  Trizol一步法提取的总RNA经紫外线分光光度计检测纯度（OD260/OD280）在1.8以上。体外培养的HTCs总RNA经逆转录、扩增后得到目的基因MMP-3，MMP-9的片断分别约为432 bp（碱基），362 bp，扩增出的内参β-actin片断约为776 bp，与预期结果一致。?譹?訛体外培养的HTCs中MMP-3和MMP-9 mRNA有一定量的表达（见图1、图2）。?譺?訛实验数据见表1，表2。经Levene方差齐性检验，P>0.05，因此各组方差齐性，故采用单因素六水平方差分析，F值分别79.935和66.514，P<0.05，总的来说：四种不同浓度TNF-α调节HTMc表达MMP-3 mRNA/β-actin灰度比值和MMP-9 mRNA/β-actin灰度比值有差别（见表1，表2）。经LSD两两组间多重比较：对照组与实验组三种不同浓度TNF-α相比调节人眼小梁网细胞（human trabecular meshwork cells，HTMc）表达MMP-3 mRNA/β-actin灰度和MMP-9 mRNA/β-actin灰度比值差异均有显著性（P<0.05）。提前30 min加入PDTC，MMP-3/β-actin灰度比值和MMP-9 mRNA/β-actin灰度比值均较未加入PDTC处理组明显减少（P<0.05）。

    2.1.2  酶谱分析（zymography）技术对MMP-3和MMP-9的定量分析  用含有酪蛋白或明胶的SDS-PAGE对MMP-3或MMP-9的活性检测结果表明，各组细胞培养液均可使酪蛋白底物和明胶水解（见图3、图4）。实验数据见表1和表2，经Levene方差齐性检验，P>0.05，因此各组方差齐性，故采用单因素六水平方差分析，F值分别169.203和40.193，P<0.05，总的来说：四种不同浓度TNF-α 调节 HTMc 表达MMP-3和MMP-9条带酶解量均有差别。经LSD两两组间多重比较：对照组与实验组TNF-α终浓度分别为1 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml相比调节 HTMc表达MMP-3和MMP-9条带酶解量（P<0.05）。提前30 min加入PDTC，MMP-3和MMP-9条带酶解量均较未加入PDTC处理组明显减少（P<0.05）。

    3  讨论

    3.1  MMPs与POAG的关系  POAG是主要的致盲眼病之一，其发病机制尚未完全阐明，眼压升高及其视神经损害是其主要特征。许多学者发现POAG患者小梁网中细胞外基质异常堆积，如：弹力样纤维鞘源性物质、弹力蛋白、纤维连接蛋白增多[5]。

    MMPs属于Zn2＋依赖性内肽酶家族，在自然生理和病理过程中的细胞外基质降解过程中发挥重要作用。MMPs家族成员目前有25个，而且仍有新成员不断加入。根据底物的特异性的不同分为5大类[6]：①胶原酶。②明胶酶。③基质溶素。④膜型。⑤其他MMPs。其中MMP-3是一种基质溶素，可降解包括Ⅲ，Ⅳ，Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅸ，Ⅹ 型胶原、层黏连蛋白、蛋白多糖和纤维连接蛋白等在内的许多ECM成分，在胚胎发育和组织塑型中起着不可取代的作用[7]；MMP-9又名明胶酶B，具有降解变性胶原分子及天然Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原的活性，其抑制剂为TIMP-1和TIMP-2。

近年来的研究表明，生理状态下房水中的MMPs与TIMPs可能绝大多数来源于血液，部分来源于角膜、睫状体和小梁网等周围组织细胞，其中包括MMP-1，MMP-2，MMP-7，MMP-9和TIMP-1，TIMP-2[8]。实验和临床研究表明，POAG时MMPs有不同程度的表达及活性的改变。Schl?觟tzer-schrehardt等[9]应用Western印迹法、特异免疫分析法、zymography法分析来自POAG患者的房水标本，检测出MMP-2，MMP-3，MMP-7，MMP-9，MMP-12和TIMP-1，TIMP-2，并且TIMPs的含量超出MMPs含量的6~7倍，而内源性激活的MMP-2的水平显著下降。Bradley等[10]在人类器官外植块灌注模型中，在灌注介质中加入等量的活化的MMP-3和MMP-2，MMP-9，房水流出通畅率增加160%。相反，当灌注介质中加入TIMP-2，灌注量将比处理前减少40%。这些研究表明房水中局部MMP-TIMP平衡的改变及MMP活性的降低可能增加小梁网异常的细胞外基质的堆积，增加房水流出阻力，这可能涉及POAG的发病机制。

    3.2  TNF-α、MMP-3和MMP-9与POAG的关系     TNF-α主要有激活的单核-巨噬细胞分泌，但T细胞、B细胞、NK细胞、LAK细胞均可低水平表达TNF-α。在眼表，TNF-α主要来源于淋巴细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和上皮细胞[11]。Leonardi等[12]研究发现TNF-α能显著增加体外培养的结膜成纤维细胞MMP-1、MMP-9和TIMP-1的生成。另有发现TNF-α能上调体外培养的视网膜微血管内皮细胞MMT-MMP和MMP-9的表达，启动了视网膜微血管的形成[13]。有研究表明人眼小梁细胞分泌细胞因子TNF-α，正常房水中TNF-α的浓度保持在动态平衡中，其浓度的改变可引起疾病[14]。Samples等[15]用RT-PCR方法在小梁组织和体外培养的小梁细胞上检测到TNF-α受体存在，并且在给予外源性的TNF-α后能促进小梁细胞的增殖。激光小梁成形术（laser trabeculoplasty，LTP）是治疗POAG的一种有效的方法，术后发现房水的流出率增加，同时房水中的TNF-α分泌增加，推测两者之间存在相关性，即激光小梁成形术可能通过诱导增加细胞因子TNF-α、IL-β分泌来增加小梁的MMPs家族尤其是MMP-3及MMP-9的表达，潜在地增加ECM的降解，导致ECM从小梁间隙清除，房水流出增加[16]。但是目前发现激光小梁成形术的治疗效果不是永久性的，只能改善高眼压的症状，不能治愈此症。因此LTP→TNF-α、IL-β→MMPs→ECM→小梁网房水流出通路的研究成为热点。

    本实验研究采用RT-PCR半定量分析法和酶谱定量分析法从mRNA、蛋白质和基质金属蛋白酶的活性水平对TNF-α加强房水小梁网流出通路的机制进行体外研究。与先前从细胞内MMP-3，MMP-9蛋白水平检测结果一致，即体外培养人眼小梁细胞表达MMP-3及MMP-9，外源性给予TNF-α可促进小梁细胞MMP-3及MMP-9的表达，并且呈现剂量依赖性[11]。目前对于启动MMP-3和MMP-9表达的信号转导上游信号通路的研究日益受到关注。Alexander等[17]发现细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，Erk）—丝裂原活化蛋白（mitogen-activated protein，MAP）激酶信号转导途径涉及TNF-α对MMP表达的作用。特异性Mek抑制剂能阻断TNF-α诱导的MMP表达和Erk的磷酸化作用。Hosseini等[18]发现TNF-α处理小梁细胞能影响JNK信号途径的元件，JNK信号途径的激活诱导MMPs的表达，进而降低眼内压。可见 TNF-α在调节小梁细胞分泌MMPs过程中有JNK-MAPK和ERK-MAPK信号转导途径的参与，为青光眼的靶向治疗提供了方向。

    3.3  ＮＦ-κＢ在TNF-α对小梁细胞MMP-3及MMP-9表达影响中的作用  ＮＦ-κＢ是普遍存在于细胞浆中，以p50/p65异二聚体为形式的一种快反应转录因子，几乎存在于体内所有细胞中，且含量最高，此异二聚体与ＮＦ-κＢ的抑制蛋白（inhibitor kappa B，IκＢ）结合形成无活性状态的三聚体 。此异三聚体可以被多种刺激剂，如TNF-α，IL-1、神经生长因子、蛋白激酶C激活剂，有丝分裂原、氧化剂、细菌、病毒、免疫刺激剂、脂多糖、自由基、紫外线等激活[19-21]。激活后的ＮＦ-κＢ与IκＢ分离，转位进入胞核与靶基因启动子/增强子上的κＢ位点结合，从而调节靶基因的表达，因此被称为控制早期基因表达的开关。研究发现许多胞内核因子kappa B的活化信号都通过不同的途径汇聚于一种高分子寡聚蛋白，即丝氨酸特异性IκＢ激酶IKK。所以ＮＦ-κＢ活化的共同途径是IκＢ激酶IKK→ＮＦ-κＢ/抑制因子IκＢ→活性ＮＦ-κＢ。由ＮＦ-κＢ调节的靶基因编码蛋白至少包括：细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、黏附分子和急性期蛋白等。

  PDTC是一种抗氧化剂，是ＮＦ-κＢ特异性的抑制剂，主要功能有两方面，一方面是抑制ＮＦ-κＢ的P65亚单位，抑制ＮＦ-κＢ活化；另一方面，PDTC是金属螯合剂，可螯合一些二价阳离子，如：Zn2+，Mn2+，Mg2+等。本实验中发现在TNF-α 10 ng/ml和25 ng/ml处理组，提前30 min加入PDTC，RT-PCR、酶谱技术检测显示MMP-3，MMP-9的表达较未加入PDTC处理组明显降低，但MMP-3，MMP-9仍有表达，未被完全抑制，这说明在TNF-α上调MMP-3和MMP-9表达的信号转导中除了有ＮＦ-κB参与外，还有其他转录因子的参与。虽然对于启动MMP-3和MMP-9表达的机制目前还不是很清楚，但是在对于平滑肌细胞的研究发现是在ＮＦ-κB和AP-1的协同作用下上调MMP-1，MMP-3，MMP-9的表达[22]。

    因此我们可以推论，刺激ＮＦ-κB的活化可以增加HTCs的MMP-3和MMP-9的表达，房水中有活性的MMP-3和MMP-9增加，小梁网中异常堆积的ECM降解增加，房水流出增加，达到降低眼压，取得和激光小梁成形术相似的疗效，这有赖于对启动MMP-3和MMP-9转录的机制的进一步了解，为临床POAG的治疗提供新的思路。

【参考文献】  [1] 濮清岚，吴瑜瑜，林玲，等. 肿瘤坏死因子-α对体外培养的人眼小梁细胞基质金属蛋白酶-3和基质金属蛋白酶-9表达的影响[J]. 眼视光学杂志，2007，9（4）：217-221.

[2] Li DQ， Shang TY， Kim HS， et al. Regulated expression of collagenases MMP-1， -8， and -13 and stromelysins MMP-3， -10， and -11 by human corneal epithelial cells[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44（7）：2928-2936.

[3] Pang IH， Hellberg PE， Fleenor DL， et al. Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human trabecular meshwork cells[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44（8）：3485-3493.

[4] Rosenberg GA，Estrada EY，Dencoff JE. Matrix metalloproteinase and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain[J]. Stroke，1998，29（10）：2189-2195.

[5] Umihira J， Nagata S， Nohara M， et al. Localizaton of elastin in the normal and glaucomatous human trabecular meshwork [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，1994，35（2）：486-494.

[6] Nagase H， Woessner JF Jr. Matrix metalloproteinases[J]. J Biol Chem，1999，274（31）：21491-21494.

[7] Haas TL， Davis SJ， Madri JA. Three-dimensional type collage lattices induce coordinate expression of matrix metalloproteinases MT1-MMP and MMP-2 in microvascular endothelial cells[J]. J Biol Chem，1998，273（6）：3604-3610.

[8] Huang SH， Adamis AP， Wiederchain DG， et al. Matrix metralloproteinases and their inhibitors in aqueous humor[J]. Exp Eye Res，1996，62（5）：481-490.

[9] Schl?觟tzer-Schrehardt U， Lommatzsch J， Kuchle M， et al. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in aqueous humor of patients with pseudo exfoliation syndrome/glaucoma and primary open-angle glaucoma[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44（3）：1117-1125.

[10] Bradley JMB， Vranka J， Colvis CM， et al. Effect of matrix metalloproteinase activity on outflow in perfused human organ culture[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，1998，39（13）：2649-2658.

[11] Gamache DA， Dimitrijevich SD， Weimer LK， et al. Secretion ofproinflammatory cytokines by human conjunctival epithelial cells[J]. Ocul Immunol Inflamm，1997，5（2）：117-128.

[12] Leonardi A， Cortivo R， Fregona I， et al. Effects of Th2 cytokines on expression of collagen，MMP-1，and TIMP-1 in conjunctival fibroblasts[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44（1）：183-189.

[13] Majka S， McGuire PG， Das A. Regulation of matrix metalloproteinase expression by tumor necrosis factor in a murine model of retinal neovascularization[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43（1）：260-266.

[14] Wordinger RJ， Clark AF， Agarwal R， et al. Cultured human trabecular meshwork cells express functional growth factor receptors[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，1998，39（9）：1575-1589.

[15] Samples JR， Choi J， Miller AM， et al. Cytokine Induced production of sCD44 in the human eye[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43：E-Abstract 3956.

[16] Bradley JM， Anderssohn AM， Colvis CM， et al. Mediation of laser trabeculoplasty-induced matrix metalloproteinase expression by IL-1beta and TNF alpha[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41（2）：422-430.

[17] Alexander JP， Acott TS. Involvement of the Erk-MAP kinase pathway in TNF alpha regulation of trabecular matrix metalloproteinases and TIMPs[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44（1）：164-169.

[18] Hosseini M， Song K， Kelley MJ， et al. Involvement of JNK–MAP kinase pathway in TNF regulation of Matrix Metalloproteinases[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2004，45：E-Abstract 4380.

[19] Grumont RJ， Gerondakis. S1 Rel induces interferon regulatory factor 4（IRF-4） expression in lymphocytes：modulation of interferon-regulated gene expression by Rel/nuclear factor–kappa B[J]. J Exp Med，2000，1919(8）：1281-1292.

[20] Chen F， Castranova V， Shi X， et al. New insights into the role of nuclear factor -κB， a ubiquitous transcription factor in the initiation of diseases[J]. Clin Chem，1999，45(1）：7-17.

[21] Raffi G， Raelene G， Mathis G， et al. Rel/ NF-κB transcription factors：key mediators of B-cell activation[J]. Immunol Rev，2000，176(1）：134-140.

[22] Bond M， Chase AJ， Baker AH， et al. Inhibition of transcription factor NF-kappa B reduces matrix metalloproteinase-1，-3 and-9 production by vascular smooth muscle cells[J]. Cardiovasc Res，2001，50(3）:556-565.