HBs Ag阴性、HBV DNA阳性献血者病毒感染特征研究

乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)在全球范围内广泛流行，在我国由于疫苗使用的普及降低了HBV的感染，但一般人群血清表面抗原(HB-sAg)的流行率仍高达7.18%。血清HBsAg广泛用于健康人群体检、献血者筛查HBV感染，但在一部分血清HBsAg检测阴性者的肝组织细胞或外周循环血清中存在HBVDNA，包括窗口期感染和隐匿性HBV感染，是献血者血清HBsAg筛查后输血传播HBV感染的主要原因。不同地区人群中HBsAg阴性、HBVDNA阳性感染的流行特点和发生原因不一，了解献血人群中的流行情况以及病毒感染的特点，分析感染发生的可能机制，可为输血传播HBV感染残余风险的评估、探讨新的检测方法提供基础。目前，核酸检测在我国已广泛用于献血者筛查，能检测出HBsAg阴性、HBVDNA阳性的感染者。因此，本研究拟对上海地区献血人群中血清HBsAg阴性、HBVDN八阳性感染者进行病毒血清学、病毒基因型和血清型检测以及病毒表面蛋白突变分析，以初步获得献血人群中的流行和感染特点。　　材料与方法　　1 标本来源2010年9～12月经上海市血液中心化验室常规筛查合格，即血清HBsAg阴性、抗-HCV阴性、抗-HIV阴性、抗-TP阴性、ALT正常的献血者标本92853例，采用CobasTaqScreenMPX(RocheCobasS201)进行6份混样检测，对结果阳性标本再采用COBASTaqMan进行单个样本核酸扩增，定量分析。结果确认12例HBVDNA阳性，获得18例标本血清可供进一步分析。　　2 主要试剂和仪器乙型肝炎病毒核心抗体诊断试剂盒和乙型肝炎病毒表面抗体定量检测试剂盒均为北京万泰生物药业有限公司产品。病毒DNA/RNA抽提试剂盒为天根生化科技(北京)产品。胶纯化回收试剂盒和TaqDNA聚合酶为宝生物工程(大连)产品。酶标仪为美国BIO-RADMode1680,PCR扩增仪为美国BIO-RADPTC-200。　　3 HBV血清标志物检测采用酶联免疫法(ELISA)检测标本血清抗-HBc和抗-HBs，操作步骤和结果判断依据试剂盒说明书进行。　　4 病毒核酸抽提和扩增采用200川血清进行病毒核酸抽提，操作方法按照试剂说明书进行。根据Genbank中HBV全基因组序列、primers软件设计HBVDNAS区上、下游引物序列，分别为5'-GGTCACCATA'ITCTTGGGAA-3‘和5‘一AATG-GCACTAGTAAACTGAG-3'。对标本DNA进行2次PCR扩增，扩增体系总体积50川，包括5ul10XPCRbuffer(含15mmol/I.MgC12)，4u2.5mmol/LdNTP,1u10umol/L上、下游引物，0.25u热启动Taq酶(5unit/ul)和10ulDNA模板。反应条件为:95℃变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸40s，循环35次;72℃延伸10min。第2次反应取2u第1次反应产物。每次反应从抽提到扩增均设立阴性血浆或ddH2O作为阴性对照。　　5 病毒基因分型及表面蛋白突变分析　　对标本HBVS区第2次PLR的产物进行琼脂糖凝胶电泳，阳性扩增产物进行胶回收纯化后，采用正、反向引物进行双向全自动测序(上海生物工程有限公司)，(1)将产物序列与Genbank中HBV序列进行Blast比对，根据S区序列与Genbank中HBV序列的差异度簇4%确定产物基因型，对标本HBV毒株进行基因分型;(2)采用DNAMANversion6软件进行S区蛋白表达分析，根据S蛋白第122位(赖氨酸Lys,d或精氨酸Arg,y)和160位氨基酸(赖氨酸Lys,w或精氨酸Arg,r)确定标本毒株的血清型从.(3)与Genbank中相应的HBV序列进行比较，观察S区编码蛋白突变情况。　　6 统计学处理应用SPSS13.0软件进行统计学分析。　　结果　　1 HBsAg阴性献血人群中HBVDMA阳性感染率上海地区血清HBsAg阴性献血人群HBVDVA阳性感染率约为0.045%(42/92853)。　　2 标本HBV血清病毒载量及血清标志物18例标本采用COBASTaqMan定量分析，结果病毒载量均低于200IU/ml，其中大部分标本(12例，66.67%)病毒载量低于20IU/ml。对标本进行病毒血清标志物抗-HBc和抗-HBs检测，14例(77.78%)为抗-HBc和/或抗一HBs阳性，其中11例(61.11%)为抗-HBc单独阳性，3例为抗-HBs阳性。均为弱保护水平(6100IU/I)。　　3 标本HBV基因型、血清型及表面蛋白突变情况对18例标本的HBVS区PCR产物进行测序后，与GenBank中HBV进行Blast比对，结果10例为B基因型，8例为C基因型。对S区基因编码的氨基酸序列进行比较分析，在14例血清抗-HBc和/或抗-HBs阳性样本中，13例标本S蛋白主要亲水区(MHR)氨基酸位点发生了突变，4例血清阴性标本中未发现MHR氨基酸位点突变。在8例发生突变的B基因型标本中，Q101K/H,M103T/I,F134L、位点突变各发生6次，D144A位点突变发生5次;在5例发生突变的C基因型标本中。S114T/A,T118K/R,K141T,S143T位点突变各发生2次。B基因型标本中8例为adw血清型，另外2例第122位氨基酸发生突变，导致其血清学发生改变，其中标本N12发生K122E突变，其血清型发生未知改变，标本N24发生K122R突变，其血清型改变为ayw。C基因型中6例为adr血清型,2例为adw血清型。　　讨论　　HBsAg阴性、HBVDNA阳性献血者是血清HBsAg筛查后输血传播HBV感染的主要原因。在不同人群中其感染的流行率不一，本研究发现上海地区的HBsAg阴性献血人群中HBVDNA阳性感染率为0.049%，低于闽南地区同类研究报告的0.2%(P<0.01)，这种差异可能是由于不同地区人群感染的流行率不一，也可能是由于不同研究中所采用的核酸检测方法不同。本研究中所采用的Roche核酸检测方法为上海市血液中心献血者常规筛查方法，其HBVDNA最低检测限95%可信度可达3.7IU/ml。　　根据HBV的全基因序列>8%，目前将HBV分为A-I9种基因型。不同地区HBV感染的基因型不同。以往有对上海地区小量HBsAg阳性样本分析均为B,C型感染,Candotti等对东南亚隐匿性HBV感染者研究发现也均为B,C基因型，而欧洲隐匿性HBV献血者病毒株均为A和D基因型。本研究对18例HBsAg阴性、HBVDVA阳性献血者分析结果均为B和C基因型感染.未发现其他基因型。HBV抗原血清型与基因型具有一定的相关型，一种基因型有2-3种与之相对应的血清型。本研究中，2例I3基因型标本S蛋白分别发生K122E和K122R位点氨基酸突变，导致其血清学发生未知改变和ayw改变外.其余标本均为adw或adr血清型。　　HBV感染后血清转换前的窗口期以及隐匿性HBV感染均可造成血清HBsAg检测阴性。隐匿J胜HBV感染是一种特殊形式，感染者病毒往往处于复制抑制状态，循环血清病毒载量低(通常<200IU/ml)，可有或无抗一HBc和/或抗一HBs。HB-sAg是HBV包膜的主要蛋白.暴露在表面的99-169位氨基酸为主要亲水区(MHR)，其中的“a”决定族(124-147氨基酸)位点是刺激B细胞产生抗体以及现有诊断试剂抗体结合的主要靶点。近年来的研究发现，“a”决定族表位及其周围MHR氨基酸位点突变可抑制HBsAg表达和/或降低HBsAg与诊断试剂抗体的结合能力，从而导致HBsAg检测阴性，是隐匿性HBV感染的主要原因‘’’竺本研究发现18例HBsAg阴性、HBVDNA阳性献血者血清病毒载量均低于200IU/ml，且绝大部分低于20IU/ml.这与窗口期感染病毒水平低和隐匿　　性感染病毒处于高度的复制抑制状态一致。对标本进行病毒血清标志物和表面蛋白突变分析，4例血清阴性的样本均未出现MHR氨基酸位点的突变，由于献血者样本不便随访，因此初步确定该4例献血者可能为窗口期感染;其余14例抗一HBc和/或抗一HBs阳性献血者为隐匿性感染，其中绝大部分发生了MHR基酸位点的突变，表明病毒表面蛋白突变可能是引起隐匿性HBV感染发生的原因之一。在本研究中，B基因型样本较多发生Q101K/H,M103T/I,F134I和D144A位点突变，C基因型样本较多发生S114T/A,T118K/R,K141T和S143T位点突变，这些相对集中的突变位点是否是导致HBsAg检测阴性的主要原因在我们发现的这些突变位点中，已有报道P120A,K122E,K122R,F134L和D144A位点的突变能降低HBsAg与检测试剂的结合能力，T118K可能改变决定簇蛋白的结构,M103I,K122R和G145A位点的突变可降低HBsAg的表达水平，而其他位点.尤其是发生频率相对较高的突变位点是否也会导致HBsAg抗原性改变或分泌水平降低，还需要进一步研究。　　上述研究结果初步说明:①上海地区HBsAg阴性献血人群中存在HBVDNA阳性的感染者，采用核酸筛查可以进一步降低HBV输血传播的残余风险;②HBsAg阴性、HBVDNA阳性献血者血清病毒载量低。感染病毒全部为B和C基因型，主要为adw和adr血清型;③HBsAg阴性、HBVDNA阳性献血者大部分为隐匿性HBV感染，少数可能为窗口期感染;且隐匿性HI3V感染病毒多发生表面蛋白氨基酸位点突变。可能为隐匿性HBV感染发生的原因之一。