Tempol对紫外线照射所致HaCaT细胞损伤保护作用

　　作者：于洋,王国英　　作者单位：青岛大学医学院，山东 青岛 266021 1 附属医院皮肤科; 2 免疫学教研室

　　【摘要】目的 观察氮氧化物4羟基2,2,6,6四甲基哌啶(Tempol)对中波紫外线(UVB)照射所致人角质形成细胞(HaCaT细胞)损伤的保护作用,并探讨其发生机制。方法 在HaCaT细胞培养系统中加入不同浓度的Tempol进行培养，12 h后洗掉培养液中的Tempol，用30 mJ/cm2 UVB照射细胞后，重新加入培养液继续培养24 h。用MTT法检测细胞增殖活性，流式细胞术测定细胞凋亡率。RTPCR方法测定FoxO3a和 BubR1基因的表达。结果 UVB照射组与正常对照组相比，细胞增殖活性明显降低(F=27.71，q=13.57,P<0.05)， FoxO3a mRNA的表达明显增强(F=13.93,q=9.79,P<0.05),BubR1 mRNA的表达明显减弱(F=29.69,q=14.54,P<0.05)， 凋亡率明显增高(χ2=93.69,P<0.05);与UVB照射组相比,不同浓度的Tempol可以恢复UVB照射细胞的增殖能力(q=3.24～13.60,P<0.05),降低照射细胞的凋亡率(χ2=12.02～101.02,P<0.05),下调FoxO3a mRNA的表达(q=2.92～9.95,P<0.05),上调BubR1 mRNA的表达(q=2.97～14.61,P<0.05)。结论 Tempol可以保护HaCaT细胞免受UVB照射造成的损伤。

　　【关键词】 紫外线;辐射损伤;实验性;环氮氧化物;HaCaT细胞;细胞凋亡;FoxO3a基因;BubR1基因

　　PROTECTION OF TEMPOL AGAINST UVB IRRADIATIONINDUCED DAMAGE ON HaCaT CELLS YU YANG, WANG GUOYING (Department of Dermatology,The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China); [ABSTRACT] Objective To study the protection of nitroxide 4hydroxy2,2,6,6,tetramethyl piperidin (Tempol) against UVB irradiationinduced damage on cultured HaCaT cells and its mechanism. Methods HaCaT cells were cultured with different concentrations of Tempol. After 12 hours of incubation, Tempol was washed away, and the HaCaT cells were irradiated with UVB for four seconds followed by 24 hours of incubation with fresh medium. Cell proliferation ability was studied with MTT assay and cell apoptosis analyzed by flow cytometry. Gene expressions of FoxO3a and BubR1 were detected by RTPCR. Results Compared with the control, in UVB group, HaCaT cell proliferation activity was suppressed (F=27.71,q=13.57,P<0.05), the expression of FoxO3a mRNA was significantly increased (F=13.93,q=9.79,P<0.05); the apoptoic rate was significantly enhanced (χ2=93.69,P<0.05) and BubR1 mRNA was significantly decreased (F=29.69,q=14.54,P<0.05). Compared with the UVB group, different concentrations of Tempol could significantly increase the proliferation ability (q=3.24-13.60,P<0.05) and decrease the apoptotic rate of UVBirradiated HaCaT cells (χ2=12.02-101.02,P<0.05). Furthermore, Tempol could significantly downregulate the mRNA expression of FoxO3a (q=2.92-9.95,P<0.05) and significantly upregulate the expression of BubR1 mRNA (q=2.97-14.61,P<0.05) of UVBirradiated HaCaT cells. Conclusion Tempol could protect HacaT cells against UVB irradiationinduced cell damage.

　　[KEY WORDS] Ultraviolet Rays; Radiation injury, experimental; Cyclic Noxide; HaCaT cell; Apoptosis; FoxO3a gene; BubR1 gene

　　长期大量的日光照射可引起皮肤光损伤。其中主要对皮肤产生损害的是中波紫外线(UVB)。表皮所含的色基吸收了UVB后，在多种酶和过渡金属离子参与下生成氧自由基(ROS)，造成皮肤氧化性损伤。UVB是皮肤晒伤及皮肤肿瘤的主要诱发因素。目前，除了化妆品性质的遮光剂，对紫外线引起的皮肤损伤临床上尚未有较好的预防措施。氮氧化物是20世纪80年代发现的一组新的抗氧化剂，氮氧化物具有相对分子质量小，性质稳定，细胞通透性好，无毒性，有类似超氧化物歧化酶(SOD)的抗氧化作用等特点，可以直接清除组织细胞内的自由基[1,2]。已有报道，氮氧化物能够减少缺血再灌注损伤、炎症反应中氧化性损伤和肿瘤放疗副作用，以及提高放疗耐受剂量等作用[3～6]。氮氧化物对UVB照射引起的角质形成细胞的损伤是否有保护作用鲜有报道。本实验旨在探讨不同浓度的氮氧化物4羟基2,2,6,6四甲基哌啶(Tempol)对UVB照射引起的人角质形成细胞(HaCaT细胞)损伤的保护作用及其作用机制，为将来临床开发应用氮氧化物提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 HaCat细胞 由青岛大学药理学教研室王春波教授惠赠。

　　1.1.2 主要仪器和设备 UVB紫外线辐射仪由北京师范大学光电仪器厂生产，流式细胞仪由美国Becton Dickinson公司生产，酶联免疫检测仪由BioRad Modal 550 USA公司生产,CO2培养箱由美国Memmert公司生产，倒置相差显微镜由日本Olympus公司生产, 高速离心机由美国Sigma 113 Germany公司生产， PCR扩增仪由法国Eppendorf Germany生产，紫外线透反凝胶成像仪由VilberLorumat公司生产。

　　1.1.3 主要药品与试剂 Tempol、四甲基偶氮唑蓝(MTT)由美国Sigma公司生产，DMEM由美国Invitrogen Corporation生产，胎牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司生产,Annexin VFITC试剂盒由深圳晶美生物有限公司生产，RTPCR试剂盒由TaKaRa生产，100 bp DNA Ladder由日本TOYOBO生产，西班牙琼脂糖由Biowest生产，碘化丙啶、胰蛋白酶由北京中昊时代生物科技公司生产,乙二胺四乙酸钠(EDTA)由上海生工生物工程公司生产,二甲基亚砜(DMSO)由天津市天河化学试剂厂生产。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 HaCaT细胞的处理和分组 用含体积分数0.10胎牛血清DMEM培养基调整HaCaT细胞密度为5×107/L,接种至96孔板和6孔板中,CO2培养箱培养,细胞融合到80%以上时分组，96孔板每组设6个复孔，6孔板每组设3个复孔。正常对照组:培养的细胞液中不加Tempol，不接受UVB紫外线照射; UVB组:采用 30 mJ/cm2的UVB照射培养细胞,辐照距离10 cm;0.5 mmol/L Tempol + UVB组(A组)，1.0 mmol/L Tempol + UVB组(B组)，2.0 mmol/L Tempol + UVB组(C组)，4.0 mmol/L Tempol + UVB组(D组)及8.0 mmol/L Tempol + UVB组(E组)分别在培养孔中加入相应浓度的Tempol，培养12 h，然后弃去药物，PBS洗涤1次，采用30 mJ/cm2 UVB照射细胞,辐照距离为10 cm,然后重新加入培养液后续培养24 h。细胞被UVB照射后，分别进行细胞活性、细胞凋亡及基因表达测定。

　　1.2.2 MTT方法检测细胞活性 细胞经UVB照射及后续培养24 h后吸去上清液，每孔加20 μL MTT(MTT终浓度为5 g/L),在CO2培养箱中培养4 h，然后吸出MTT并加入DMSO 200 μL,振荡10 min，检测MTT。以空白对照组为基准，在波长490 nm处检测吸光度(A)值。

　　1.2.3 流式细胞仪测定细胞凋亡率 细胞经UVB照射及后续培养24 h后吸去上清液，用4 ℃预冷的PBS洗2次，加入250 μL Binding Buffer重悬细胞，调节其密度为1×109/L，取100 μL的细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μL的Annexin VFITC和20 mg/L的碘化丙啶溶液10 μL，混匀后于室温避光孵育15 min，在反应管中加400 μL的PBS，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

　　1.2.4 RTPCR检测细胞内FoxO3a及BubR1的基因表达 Trizol法提取总RNA，紫外线分光光度计测定RNA浓度和纯度。取样本RNA 1 μg，按TaKaRa的RTPCR试剂盒完成反转录。PCR总反应体系为50 μL，其中10×PCR BufferⅡ 5 μL，dNTP Mixture　2 μL，TaKaRa E×TaqHS 0.5 μL，目的基因及βactin上下游引物各0.5 μL，cDNA5 μL，加Rnase Freed H2O2至50 μL。扩增条件: 94 ℃ 变性3 min，1个循环，94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s(FoxO3a)或65 ℃ 40 s(BubR1)，72 ℃ 40 s，40个循环。引物序列如下：FoxO3a，上游:5′AACTCCCTACGCCAGTCTCC3′,下游:5′AAATCCAACCCATCAGCATC3′，片段长度为599 bp;BubR1，上游:5′TGTTCTGGCTTGGAGCCTTG3′，下游:5′TCTCGGCAAACTCTGTTGGC3′，片段长度为166 bp;βactin，上游:5′CTTCCTGGGCATGGAGTC3′,下游，5′GCCGATCCACACGGAGTA3′, 片段长度为 237 bp。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，在紫外线透反凝胶成像仪下成像检测。

　　1.3 统计学处理

　　结果以±s表示，数据间比较采用方差分析及χ2检验，应用SPSS 11.5及PPMS 1.5[7]统计软件进行数据处理。

　　2 结 果

　　MTT法检测细胞增殖活性显示，未经照射的正常对照组细胞具有良好的细胞增殖能力和较好的细胞活性，UVB组细胞增殖活性较正常对照组明显降低(F=27.71,q=13.57,P<0.05);流式细胞仪检测细胞凋亡率显示,UVB组细胞凋亡率高于正常对照组(χ2=93.69,P<0.05)。与正常对照组相比较，UVB组细胞的FoxO3a mRNA的表达明显增强(F=13.93,q=9.79，P<0.05),BubR1 mRNA的表达明显减弱(F=29.69，q=14.54，P<0.05)。

　　MTT法检测细胞增殖活性显示，A～E组细胞的细胞增殖活性均明显高于UVB组，差异有显著性(q=3.24～13.60,P<0.05)，但细胞增殖活性随着Tempol浓度的增加而呈逐渐减小的趋势。A～E组的细胞凋亡率均明显低于UVB组，差异有显著性(χ2=12.02～101.02，P<0.05)，但凋亡率随着Tempol浓度的增加而呈逐渐增加的趋势。 RTPCR方法及紫外线透反凝胶成像仪成像显示，A～E组与UVB组相比， FoxO3a mRNA的表达均明显减弱(q=2.92～9.95,P<0.05)，BubR1 mRNA的表达明显增强，差异有显著性(q=2.97～14.61,P<0.05)。见表1，图1。表1 不同浓度Tempol联合UVB对HaCaT细胞的影响

　　3 讨 论

　　日光中损伤人皮肤的主要是UVB，UVB照射与皮肤产生红斑、水肿、水疱等光毒性反应、光变态反应及皮肤肿瘤有密切关系[8]。皮肤中所含的各种色基吸收紫外线后呈激发状态，随即与皮肤中的分子氧发生Ⅰ型或Ⅱ型光动力反应，并在多种酶和过渡金属离子参与下生成氧自由基。这些氧自由基可引起细胞氧化性损伤[9,10]。而寻找各种抗氧化物来抵抗紫外线引起的氧化性损伤成为研究的热点。20世纪80年代末，氮氧化物作为一类新的抗氧化剂被发现[1,2], 它在抗氧化损伤方面表现出了很有价值的应用前景。本实验探讨了Tempol保护人类HaCaT细胞免受紫外线照射引起的损伤作用。研究结果显示，UVB照射能够抑制HaCaT细胞的增殖，加强HaCaT细胞的凋亡。而Tempol能够保护HaCaT细胞免受UVB引起的多种损伤。

　　在本实验中，HaCaT细胞经UVB辐射后，细胞的增殖功能明显降低，细胞凋亡显著增强，说明UVB照射对HaCaT细胞有一定的损伤作用，此结果与其他研究者的报道相符[11]。但是，若在UVB照射前，在HaCaT细胞培养系中加入0.5 mmol/L的Tempol，则能保护HaCaT细胞使其增殖活性与凋亡率维持在正常水平，说明Tempol具有保护细胞免受UVB照射引起的损伤的作用。由于UVB引起的细胞损伤主要通过诱发局部皮肤氧自由基的产生而引起，而Tempol是一种自由出入细胞的抗氧化剂，因而我们推测，Tempol的保护作用可能与其抗氧化性损伤有关。随着Tempol浓度的增加，其保护作用逐渐减弱，提示Tempol的保护作用与其剂量有关，在实际应用中应选择最佳浓度。

　　FoxO3a 是一种转录蛋白，调节细胞凋亡分子及抗细胞增殖分子的表达，具有抑制细胞增殖，促进细胞凋亡的作用[12];另外，FoxO3a还有抗氧自由基损伤及保护细胞DNA免受损伤的作用[13]。本实验结果显示，UVB照射诱发了HaCaT细胞FoxO3a基因高表达，这可能与UVB照射引起局部组织内氧自由基浓度增高，从而诱发细胞内FoxO3a 开始表达合成，发挥其抗氧自由基损伤的作用有关;而FoxO3a分子增多，反过来进一步导致细胞增殖功能降低、增强细胞凋亡。 HaCaT细胞在UVB照射前用Tempol 培养12 h，则FoxO3a基因表达与对照组无明显差异，这可能与Tempol消除UVB照射引起的细胞内氧自由基，从而阻止FoxO3a基因高表达有关。

　　基因BubR1在组织中随机体衰老表达逐渐降低, BubR1与机体老化及生育有关。BAKER等[14]报道，在BubR1表达较低的小鼠，随着年龄的增长体内DNA氧化性损伤的累积要多于BubR1 正常表达的小鼠。本文实验结果显示，UVB照射引起BubR1基因表达降低，提示UVB照射导致细胞衰老，而Tempol通过阻止UVB的氧化性损伤，防止细胞的衰老，维持了BubR1基因的正常表达。

　　综上所述， UVB照射引起角质形成细胞的损伤，FoxO3a基因和BubR1基因可能参与这种损伤过程。Tempol能够保护角质形成细胞而减少UVB引起的损伤，在一定范围内可促进角质形成细胞增殖，抑制凋亡。但本实验为体外研究结果，而角质形成细胞的生长增殖还受体内多种因素的影响，所以，Tempol对UVB照射下的角质形成细胞的保护作用及作用机制还有待进一步探讨。

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