隐球菌保护性肽表位GMFDGLSGV多聚体的免疫原性研究

　　作者：谷明莉，钱琤，周晔，陈波，陈孙孝，邓安梅，仲人前 作者单位：解放军第二军医大学上海长征医院，实验诊断科;皮肤科，上海 200003

　　【摘要】目的 探讨纯化的隐球菌抗原肽GMFDGLSGV二聚体、四聚体、八聚体重组蛋白激发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫应答的能力，为新型隐球菌疫苗的研制打下基础。方法 通过细胞增殖和细胞毒性实验，研究纯化的GMFDGLSGV单体、二聚体、四聚体、八聚体重组蛋白刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性，初步鉴定重组多聚体的免疫原性。结果 10例HLAA*0201阳性个体PBMC对八聚体的平均SI为37.4±3.07;增殖反应明显高于四聚体(平均SI为20.1±1.37)、二聚体(平均SI为14.1±1.06)、单体(平均SI为11.4±0.68)以及阴性对照(平均SI为1±0.10)引起的细胞增殖反应(P<0.01)。在抗原肽诱导的CTL细胞毒活性中，HLAA*0201阳性个体PBMC对八聚体、四聚体、二聚体、单体及阴性对照组均表现不同程度的杀伤活性，平均活性分别为48.1±4.28、23.9±2.20、16.3±1.27、13.1±1.10、1.0±0.1(P<0.01)。结论 本研究得到的重组优化八聚体具有较好的免疫原性，能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性，为进一步开发有效的隐球菌疫苗打下了基础。

　　【关键词】 结核分枝杆菌 多聚体 疫苗

　　Investigation of Immunogenicity of Multimer Peptides from Mtb

　　Gu Mingli, Qian Cheng, Zhou Ye, Chen Bo, Chen Sunxiao, Deng Anmei, Zhong Renqian

　　(Laboratory Diagnostics;Department of Dermatology, Shanghai Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003,China)

　　Abstract： Objective To investigate immunogenicity of multimer peptides from mycobacterium tuberculosis (Mtb).Methods Cellular proliferation and cytotoxicity experiments were performed to evaluate the immunogenicity of recombinant multimer peptides from Mtb. Results Multimer peptides (10 μΜ) could stimulate proliferation of peripheral blood monocytes (PBMCs) from all of 14 HLAA*0201 positive (A2+) PPD+ healthy candidates, strikingly stronger than those of single peptide’s and PPD’s groups (average stimulation index as 37.4±3.07 versus 20.1±1.37 or 14.1±1.06 or 11.4±0.68 or 1±0.10, respectively, P<0.01). CTLs induced by multimer peptides were used as effector cells in a CTL assay against T2 cells loaded with single peptide (10 μΜ). Multimer peptides could induce CTL cytotoxic activity in all of the 14 A2+PPD+ healthy candidates, significantly stronger than single peptide’s and PPD’s groups (average activity as 48.1±8.9% versus 23.9±9.2% or 16.3±7.8% or 13.1±8.4% or 1±10%, respectively, P<0.01). Conclusion The recombinant octamerous peptide from Mtb can stimulate greater proliferation and cytotoxicity of PBMCs, which is helpful for designing new vaccine.

　　Key words： mycobacterium tuberculosis; multimer peptide; vaccine

　　在隐球菌感染中，隐球菌性脑膜炎的发病率近年来呈现出逐年上升的趋势，且易发于细胞免疫功能受损的人群[1～2]。由于其病状重、病死率高等特点，已引起临床医生的高度重视。在艾滋病患者中，并发新生隐球菌感染率高达30%，是爱滋病患者最主要的死亡原因之一[3]。长期使用糖皮质激素、免疫抑制剂和患癌症的病人隐球菌的感染率也在急速攀升[4]。虽然抗隐球菌的保护性免疫机制目前仍不清楚，但细胞免疫尤其是循环及感染部位的T细胞免疫起重要作用[5～6]。体内持续存在的抗原引起相应的免疫应答而产生的大量抗原特异性T细胞是机体免疫性保护作用的基础。因此PBMCs对隐球菌抗原的应答，可作为研究抗隐球菌保护性免疫的良好模型。HLAA*0201在多数人群中普遍存在，其频率>40%。因此，进行隐球菌抗原HLAA*0201限制性T细胞表位疫苗的研究具有重大的现实意义[7～8]。本研究采用HLAA*0201阳性个体的PBMC对候选表位或抗原的免疫反应性来验证其免疫原性，探讨纯化的隐球菌抗原肽重组多聚体激发CTL免疫应答的能力，为抗隐球菌疫苗的设计打下基础。为了更加有效地达到预防和治疗目的，我们设计了含有可引导表位肽进入抗原提呈细胞的“木马肽”序列以及PADRE泛Th表位，并采取了高尔基体内固有肽酶furin识别序列作为表位接头的“串珠式” GMFDGLSGV多聚体[6]。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 10例HLAA*0201阳性志愿者，10例HLAA*0201阴性志愿者，留取外周血20 ml，肝素抗凝。

　　1.2 试剂和试剂盒 FITC标记的抗CD3、抗CD8、抗HLAA2流式单克隆抗体均为Caltag公司产品;时间分辨荧光DELFIA细胞增殖(AD0200)与细胞毒性(AD0016)检测试剂盒均购自Wallac Oy公司;HLAA2高分辨SSPPCR试剂盒购自One Lamda公司; LPS、人重组IL2、人重组GMCSF、人重组IL4购自R&D公司; T2细胞株由上海长征医院临床实验诊断科保存。

　　1.3 重组表位肽的制备 选取隐球菌抗原表位GMFDGLSGV，引入Th表位PADRE及木马肽序列(RKKRRQRRR)，并以RVKR序列作为接头，分别合成隐球菌保护性肽表位GMFDGLSGV二聚体、四聚体、八聚体全基因序列，经 PCR扩增后分别插入融合表达载体pGEX4T1，将重组质粒转入大肠埃希菌BL21并以IPTG诱导表达，进一步经GST亲合层析柱纯化，得到重组表达蛋白，方法参见文献[9] 182～185。

　　1.4 HLA分型 先以鼠抗人HLAA2单克隆抗体(BB7.2)进行HLAA2流式细胞仪初步筛选，然后再以HLAA2高分辨SSPPCR试剂盒进一步确认其A*0201亚型。

　　1.5 抗原肽诱导CTL制备 用密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞，种于6孔细胞培养板，在含10%FCS的RPMI1640培养基中，37 ℃ 5%CO2孵育1.5 h。收集悬浮细胞，以10%二甲亚砜90%小牛血清保存于液氮备用。贴壁细胞为抗原提呈细胞—树突状细胞(DC)前体细胞，补充含GMCSF(1 000U/ml)、IL4(1 000 U/ml)及含10%FCS的RPMI1640培养液，37 ℃ 5%CO2培养7 d 促其转化，需要时补充新鲜培养液。5 d 后，加入LPS(1μg/ml)培养2 d 后促进DC成熟，γ照射使其失去增殖活性。将经过照射的DC分别与抗原肽、多聚体、HLAA*0201阳性(10 μmol/L)在培养液中，37 ℃ 5%CO2共孵过夜。分别将1×105负载的DC与1×106自体PBMC种于含10%FCS的RPMI1640完全培养液的24孔细胞培养板，37 ℃ 5%CO2混合培养3 d 后，加入rIL2(20 U/ml)继续培养10 d，进行细胞增殖实验和细胞活性检测。

　　1.6 细胞增殖实验 细胞增殖实验采用时间分辨荧光DELFIA细胞增殖检测试剂盒。分别将经辐射的5×103负载的APC 100 μl 与5×104抗原诱导的自体CTL100 μl 种植于96孔细胞培养板中(以空载的APC作为阴性对照)，与20 μl BrdU应用液共孵10 h，离心洗1遍，加入Eu标记的抗BrdU单抗室温孵育2 h，洗涤、固定后，经时间分辨荧光检测仪测定荧光强度值。每个样本设立3个复孔，取其平均值为检测结果。刺激指数(SI)=含抗原肽的平均荧光强度值/阴性对照平均荧光强度值，将SI>2的抗原肽视为能诱导淋巴细胞增殖。

　　1.7 细胞毒性分析 以抗原肽诱导CTL为效应细胞(E)，负载抗原肽的T2细胞作为靶细胞(T)，采用时间分辨荧光DELFIA细胞毒性试验测其杀伤活性。参照说明书进行操作，共培养4 h，最后检测样本荧光值。每个样本设立3个复孔，取其平均值为检测结果。细胞杀伤活性(%)=(待测孔荧光强度值-自然释放孔荧光值)/(最大释放孔荧光强度值-自然释放孔荧光值)×100%。

　　1.8 统计学方法 统计处理采用SAS 6.12 软件，用t检验分析计量资料，P<0.01认为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 抗原肽刺激细胞增殖实验结果 以细胞增殖反应评价多聚体诱导PBMC中抗原特异性CTL应答水平。结果表明，10例HLAA*0201阳性个体PBMC对八聚体的平均SI为37.4±3.07;增殖反应明显高于四聚体(平均SI为20.1±1.37)、二聚体(平均SI为14.1±1.06)、单体(平均SI为11.4±0.68)以及阴性对照(平均SI为1±0.10)引起的阳性增殖反应，统计分析P<0.01。而在HLA-A*0201阴性个体对照组中八聚体、四聚体、二聚体、单体及阴性对照也产生不同程度的阳性增殖反应， SI分别为4.3±0.26、3.8±0.30、3.2±0.29、2.4±0.19、1±0.10未出现显著的增殖反应(见图1)。

　　图1 重组多聚体可刺激较强的PBMCs增殖反应(略)

　　2.2 抗原肽诱导的CTL杀伤毒性 HLAA*0201阳性个体PBMC对八聚体、四聚体、二聚体、单体及阴性对照均表现出不同程度的杀伤活性，平均活性分别为48.1±4.28、23.9±2.20、16.3±1.27、13.1±1.10、1±0.1，统计分析P<0.01。而在HLAA*0201阴性个体对照组中，PBMC对八聚体、四聚体、二聚体、单体及阴性对照均表现出不同程度的杀伤活性，分别为5.2±0.50、4.8±0.41、4.1±0.35、3.4±0.25、1±0.1(见图2)。

　　图2 重组多聚体诱导产生较强的特异性CTL杀伤活性(略)

　　3 讨论

　　目前，对隐球菌感染的治疗依然主要停留在两性霉素B、5氟胞嘧啶和氟康唑等治疗方案上。虽然两性霉素B是系统性抗真菌治疗的金标准，但是由于其毒性作用显著及治疗时间长等弊端，不仅限制了肝肾功能不全的病人应用治疗，也无法长期用于正常患者的治疗。抗原CD8+T细胞能分泌IFNγ和TNFα等细胞因子。而在隐球菌感染的器官中输入CD8+T细胞，可明显减少该器官中隐球菌数量，证明CD8+T细胞具有很好的保护性作用[10]。

　　CTL在控制细胞内病原菌感染和肿瘤中有着重要的作用[11]，其中TCR肽MHC复合物是启动免疫应答的关键，设计有效激发CTL免疫应答的疫苗，可用于预防和治疗感染和肿瘤等疾病。CD8+T细胞免疫应答过程中，胞内蛋白被降解成多肽，由TAP复合体转运至内质网，进一步被修饰为适合MHC分子结合的8～10 aa片段并结合转运至胞外与TCR结合。因此CTL表位形成需要抗原能进入胞内发生蛋白降解过程，胞内合成的蛋白易于被蛋白酶降解，而绝大多数外源性蛋白则不能。所以由蛋白质组成的疫苗通常能有效激发较强的抗体和Th免疫应答，而诱发CTL应答能力较弱。

　　为了获得高效而特异的保护性CTL免疫应答，我们对单纯的CTL表位疫苗进行三方面的改造：(1)引入广谱高效的Th表位PADRE(Poly Alamine DR Epitope)来改善Th细胞的功能状态，以达到增强特异性CTL免疫应答。(2)引入来源于HIVI Tat 的木马肽(Trojan peptide，TA)序列(carrier)作为“向导序列”加速目的抗原的降解及提呈。TA可以转运含有T细胞表位的多肽至APC胞内，形成能被CTL识别的细胞表面肽/MHC复合物。(3)采用高尔基体固有肽酶furin识别基序作为表位间的接头，furin参与分泌途径中TAP非依赖性CTL表位处理，识别RX(R/K)R基序，从而保证各表位有效的释放和递呈[9]281～287。采用TA技术比重组病毒、质粒或蛋白更为简单。该技术是通过转运肽结构直接进入APC，以TAP非依赖机制形成CTL表位。在分泌途径中，高尔基体固有肽酶furin已经其他氨基肽酶参与TA引导表位肽的处理。因此TA技术在研发CTL疫苗，不仅在直接体内免疫还是体外致敏DC的细胞疫苗都有着广阔的运用前景。

　　本研究对表达的八聚体、四聚体、二聚体激发CTL免疫应答水平进行初步验证，发现八聚体能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应，可明显增强CTL免疫应答水平，为隐球菌疫苗的研发和设计打下了基础。

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