QLFATINSTL(93 102aa)是隐球菌抗原MP98 CTL优势表位

　　作者：谷明莉，邓安梅，周晔，陈燕，陈波，仲人前，温海，陈孙孝 作者单位：解放军第二军医大学附属长征医院，实验诊断科;皮肤科，上海 200003

　　【摘要】 目的 鉴定隐球菌抗原MP98中的HLAA*0201限制性CD8+CTL表位。方法 应用数据库SYFPEITHI预测隐球菌MP98中可能存在的HLAA*0201限制性CD8+CTL表位，经流式细胞术分析各抗原肽与HLAA*0201的亲合力，经时间分辨荧光法检测外周血单个核细胞(PBMCs)对各抗原肽产生的增殖反应，经细胞毒性实验研究各抗原肽诱导的特异性T细胞的细胞毒杀伤活性，逐步鉴定MP98的HLAA*0201限制性CD8+CTL表位。结果 位于MP98氨基酸序列肽3(93102aa)与HLAA*0201分子具有较高的亲合力，并都能刺激HLAA*0201阳性个体PBMC增殖，并诱导产生具有特异性杀伤活性的CTL。结论 肽3 QLFATINSTL(93102aa)是抗原MP98上HLAA*0201限制性CD8+CTL的优势表位，可作为隐球菌疫苗设计的候选表位。

　　【关键词】 隐球菌;细胞毒性T细胞;抗原表位

　　基金项目：本课题受国家自然科学基金(30671840)、上海市卫生局科研计划项目(044092)资助

　　Prediction and Identification of HLAA*0201 Restricted CD8+CTL Epitopes in Cryptococcus Neoformans MP98

　　Gu Mingli, Deng Anmei, Zhou Ye, Chen Yan, Chen Bo, Zhong Renqian, Wen Hai, Chen Sunxiao

　　(Department of Experimental Diagnosis; Department of Dermatology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)

　　Abstract： Objective To identify HLAA*0201 restricted CD8+CTL epitopes in Cryptococcus neoformans MP98.Methods Firstly, database SYFPEITHI was applied to predict HLAA*0201 restricted CD8+CTL epitopes in Cryptococcus neoformans MP98. Secondly, affinity and stability of the predicted peptides with T2 cell were assayed by FACS. Thirdly, cells proliferation and cytotoxicity induced by peptides were investigated by DELFIA cell proliferation assay and DELFIA EUTDA cytotoxicity test, respectively. Results Peptide 3 (QLFATINSTL, 93102aa) had high affinity to HLAA*0201 molecules, and stimulated PBMCs in healthy donors to proliferate and induce antigen specific CTLs. Only peptide 6 could give a positive proliferation response and specific cytotoxicity. Conclusion Peptide 3 (QLFATINSTL, 93102aa) is the HLAA*0201 restricted CD8+CTL epitope of Cryptococcus neoformans MP98, which shows that it can be the candidate for peptidebased vaccine.

　　Key words： Cryptococcus neoformans; epitope; cytotoxic T lymphocyte

　　近年来，隐球菌性脑膜炎的发病率呈明显上升趋势。尤易伴发于HIV/AIDS等免疫缺陷患者。该病治疗困难，治愈率低，已成为这类人群致死的主要原因之一[1～2]。在隐球菌感染的人群中只有免疫力功能较为低下的个体才易于发病，而在机体隐球菌感染中越来越多的研究表明，特异性细胞免疫发挥着重要作用。因此，开发研制新的预防和治疗隐球菌的疫苗，具有重要意义和广泛的应用前景[3]。HLAA*0201在多数人群中普遍存在，其频率>40%，进行HLAA*0201限制性CTL表位的研究将更具有现实意义。

　　本课题利用生物信息学数据库对隐球菌抗原MP98[4]中可能存在的HLAA*0201限制性CD8+CTL表位进行初步预测，然后进行抗原肽HLA分子亲合力和稳定性分析，采用时间分辨荧光法(DELIFA)对抗原肽诱导的细胞增殖反应、CTL细胞毒活性进行研究，逐步鉴定出QLFATINSTL(93102aa)是隐球菌抗原MP98 CTL优势表位。

　　1 材料和方法

　　1.1 研究对象 10例HLAA*0201阳性健康志愿者，10例HLAA*0201阴性健康志愿者，留取外周血10 ml，肝素抗凝。

　　1.2 试剂和材料 RNA抽提试剂盒购自Qiagen公司;LPS、人重组IL2、DMSO、BFA、β2mg 均购自Sigma公司;淋巴细胞分离液LymphoprepTM购自挪威AXISSHELD公司;人重组GMCSF、人重组IL4购自R&D公司;FITC标记的抗CD3、抗CD8、抗HLA.A2流式单克隆抗体均为Caltag公司产品;RPMI1640培养基和胎牛血清购自Gibco公司;时间分辨荧光DELFLA细胞增殖(AD0200)与细胞毒性(AD0116)检测试剂盒均购自Perkin Elmer公司;多肽由上海生工生物工程技术有限公司合成;T 2细胞株由上海长征医院临床实验诊断科保存。

　　1.3 主要仪器 流式细胞仪(Coulter EPICS XL);时间分辨荧光检测仪(DELFIA 1235，Perkin Elmer)。

　　1.4 HLA分型 先以鼠抗人HLAA2单克隆抗体(BB7.2)进行HLAA2流式初步筛选，然后再以HLAA2高分辨SSPPCR试剂盒进一步确认其HLAA*0201亚型。

　　1.5 表位预测和多肽合成 应用数据库SYFPEITHI对隐球菌MP 98进行HLAA*0201限制性CTL表位预测，根据多肽上的氨基酸是否为锚定残基、辅助残基或优势残基进行记分，分值高于18分者有可能是T细胞表位[5]。由上海生工生物工程技术有限公司以Fmoc化学法合成上述预测得到的多肽，合成的抗原肽均经高效液相色谱纯化(纯度>95%)，并经质谱鉴定。

　　1.6 抗原肽亲合力分析 采用T 2细胞株进行抗原肽亲和力分析，其原理主要是利用T 2细胞系的特点。T 2细胞表面空载的HLAA2分子表达极不稳定，递呈后很快降解，抗原肽与之结合后稳定了HLAA2的表达，因此抗原肽与HLAA2的结合力越强，T 2细胞表面HLAA2分子的表达量就越高。而且由于T 2细胞的内源性抗原递呈途径中必需的抗原多肽转运蛋白(TAP)缺乏，所以T 2细胞表面HLAA2分子的表达量的增加更加直观的反映了外来抗原肽与HLAA2的结合力。具体方法为：T 2细胞以pH3.2的柠檬酸钠—磷酸盐缓冲液预处理1 min，使细胞表面的MHC Ⅰ类复合物变性，立即用过量的RPMI 1640培养液洗1遍，调节细胞浓度至3×105，以1 ml/孔种于24孔细胞培养板。以抗原肽(20 mg/L)刺激，补充Brefeidin和β2MG，37 ℃ 5%CO2饱和湿度孵育4 h，并以未加抗原肽为空白对照孔。收集细胞，以FACS(含0.2%FCS和0.1%叠氮钠的PBS)洗l遍，用FITC标记的小鼠抗人HLAA*0201单克隆抗体染色，常温暗处反应30 min，流式细胞仪(Coulter EPICS XL)检测平均荧光强度。每个实验重复3次，平均荧光强度高于空白对照孔平均荧光强度+3SD的抗原肽具有HLAA*020l高亲和力。

　　1.7 抗原肽稳定性分析 T 2细胞同前预处理，将抗原肽浓度提高至80 mg/L，37 ℃ 5%CO2饱和湿度孵育18 h，补充BFA至终浓度为10 mg/L，继续孵育3 h。收集细胞，同前测平均荧光强度。平均荧光强度高于空白对照孔平均荧光强度+3SD的抗原肽具有与HLAA*0201稳定性结合特性，并将其进行细胞增殖反应及细胞毒性实验。第1期QLFATINSTL(93102aa)是隐球菌抗原MP98 CTL优势表位 谷明莉，等

　　1.8抗原肽诱导CTL制备 将密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，得到的PBMCs种于含10%FCS的RPMI 1640培养基的6孔细胞培养板中，37 ℃ 5%CO2孵育1.5 h。收集悬浮细胞(主要为淋巴细胞)。贴壁细胞为抗原提呈细胞—树突状细胞(DC)，补充含GMCSF、IL4，及含10%FCS的RPMI 1640培养液，37 ℃ 5%CO2培养7d。5 d 后，加入LPS培养2 d 后，γ照射使其失去增殖活性。将经过照射的DC与抗原肽(10 μmol/L)在培养液中，37 ℃ 5%CO2共孵过夜。将1×105负载有抗原肽的DC与1×106自体PBMCs种于24孔细胞培养板，37 ℃ 5%CO2混合培养3 d 后，加入rlL2(20 U/ml，Sigma)继续培养10 d，进行细胞增殖实验和细胞活性检测。

　　1.9 细胞增殖实验 采用时间分辨荧光DELFIA细胞增殖检测试剂盒(AD0200，Perkin Elmer)，将经辐射的5×103负载抗原肽的DC100 μl与5×104抗原肽诱导的自体CTL种于96孔细胞培养板，并以未负载抗原肽的DC作为阴性对照。加入20 μl BrdU标记液孵育10 h，离心取沉淀，加入Eu标记的抗BrdU单抗，室温孵育2 h，洗涤，固定。时间分辨荧光检测仪(DELFIA 1235)检测荧光强度，每个样本设3个复孔，取平均值为检测结果。增殖系数(SI)=含抗原肽的平均荧光强度/阴性对照的平均荧光强度，SI>2的抗原肽我们将视为能诱导淋巴细胞增殖。

　　1.10 细胞毒性分析 采用时间分辨荧光DELFIA EUTDA细胞毒性试验(AD0116，Perkin.Elmer)，检测杀伤活性。参照说明书进行操作，效应细胞与靶细胞的比例为40：1，培养4h。时间分辨荧光检测仪(DELFIA 1235)检测荧光强度，每个样本设3个复孔，取平均值为检测结果。细胞杀伤活性=(待测孔荧光强度-自然释放孔荧光强度)/(最大释放孔荧光强度-自然释放孔荧光强度)×100%。

　　2 结果

　　2.1 表位预测及多肽合成结果 经生物信息学预测，选择以下肽序列进行合成(表1)。合成的多肽经质谱鉴定，纯度经高压液相色谱(HPLC)分析均>95%。

　　2.2 抗原肽亲合力及稳定性分析结果 上述合成的抗原肽与HLAA*0201结合活性见表1。 经抗原肽3处理后的细胞平均荧光强度出现升高。 抗原肽与HLAA*0201分子结合的稳定性分析结果显示， 抗原肽与T 2细胞上的HLAA*0201分子结合后， 抗原肽3能使T 2细胞HLAA*0201分子表达稳定上调， 以T 2细胞平均荧光强度经抗原

　　表1 抗原肽刺激后的T 2细胞HLAA*0201平均荧光强度(略)

　　肽处理后的增长倍数(增长倍数=抗原肽处理后的平均荧光强度/无抗原肽的平均荧光强度)为Y轴作图(如图1所示)。根据结合力和稳定性结果，选择抗原肽3继续下游实验。

　　图1 HLAA*0201抗原肽的亲和力和稳定性(略)

　　2.3 抗原肽刺激细胞增殖实验结果 以细胞增殖反应评价抗原肽3在人PBMC中诱导抗原特异性CTL的能力，以鉴定其是否为特异性CTL表位。结果显示，以刺激系数(SI)>3为增殖反应阳性，抗原肽3(93102aa)都能刺激全部的10例A2+健康个体的PBMCs发生增殖，SI为17.3±4.5。而HLAA*0201阴性健康对照组对肽3未出现显著的增殖反应，SI为1.8±0.7(如图2所示)。

　　图2 PBMC对隐球菌抗原MP 98肽3产生的增殖反应(略)

　　2.4 抗原肽诱导的CTL杀伤毒性 以负载抗原肽的T 2细胞作为靶细胞，抗原肽诱导的CTL作为效应细胞，其中1例PBMC在效靶比分别为3：1，6：1，12：1，24：1，48：1时的特异杀伤活性见图3，由图可见效靶比为24：1时细胞杀伤活性达到峰值。

　　效靶比

　　图3 MP 98抗原肽3在不同效靶比诱导产生的CTL细胞毒活性(略)

　　以负载抗原肽的T 2细胞作为靶细胞，抗原肽诱导的CTL作为效应细胞，效靶比为24：1时，抗原肽3(93102aa)能诱导全部的10例A2+健康个体中CTL杀伤活性增高，平均为(70.85±4.5)%。而抗原肽3诱导HLAA*0201阴性健康对照组的CTL杀伤活性均<10%。(如图4所示)

　　图4 隐球菌抗原MP 98肽诱导PBMC产生特异性的CTL杀伤活性(略)

　　3 讨论

　　尽管目前抗隐球菌感染的保护性免疫应答机制还没有完全清楚，但有效的细胞介导免疫对于控制隐球菌的感染非常重要。新生隐球菌是一种具有荚膜的酵母样真菌，最常侵犯中枢神经系统引起隐球菌性脑膜炎，而清除该隐球菌细胞免疫发挥着不可替代性作用。据有关报道，T细胞的缺失或中和IFNγ加重了新生隐球菌在小鼠中枢神经系统的感染，缩短小鼠存活时间，增加其脑组织中真菌负荷，提示细胞免疫在中枢神经系统的获得性免疫保护中有重要作用。

　　抗原特异性CD8+T细胞可通过分泌Th1类细胞因子发挥免疫保护作用。在隐球菌感染宿主的保护作用中IL2和IL18发挥非常大的作用。IL12对宿主的保护作用是通过诱导产生IL18而发挥的，IL18的产生则是通过IFNγ介导的。IL12和IL18协同作用促使NK细胞分泌IFNγ提高小鼠腹膜渗出细胞的抗隐球菌能力。用新生隐球菌静脉感染严重联合免疫缺陷小鼠可观察到IFNγ单独应用在小鼠的脑、肺、肝都有治疗效果。因此对于严重免疫缺陷宿主的播散性隐球菌病，IFNγ可作为辅助治疗。有研究表明HIV患者IL12和IFNγ较低：AIDS患者IFNγ的表达降低，也都从另一个角度说明细胞免疫所发挥的重要作用[6]。

　　通过颗粒依赖性胞外分泌途径的细胞毒作用：CD8+T细胞特异性识别受染的巨噬细胞释放含穿孔素的颗粒，穿孔素在靶细胞膜上聚合形成管道，使效应分子进入靶细胞，导致靶细胞凋亡和溶解：而穿孔素和颗粒溶素协同作用，又可增加胞膜的通透性，使隐球菌胞液积聚导致菌体溶解死亡。隐球菌的保护性免疫反应有赖于特异性T细胞反应，而CTL的充分激活在激发机体产生抗隐球菌的保护性免疫反应中至关重要[7]。因此鉴定隐球菌CTL表位不仅有助于了解隐球菌特异性CD8+T细胞反应，阐明CDS+T细胞在抗隐球菌中确切的保护作用，更加有助于隐球菌疫苗的研究。

　　本研究利用数据库SYFPEITHI对隐球菌抗原MP 98进行表位预测，从中筛选出10条符合评分标准的抗原肽，经T 2细胞亲合力和稳定性分析，剔除一些亲合力较低的表位肽，结果位于93102aa的一段抗原肽，显示与T 2细胞上HLAA*0201分子有较高的结合力。其中，抗原肽QLFATINSTL使HLAA*0201阳性健康个体的PBMC发生增殖，并且由此诱导产生的抗原特异性CTL在效靶比为24：1时对负载抗原肽的T 2细胞的靶细胞杀伤活性都高于20%。

　　本研究结果表明，隐球菌MP 98中的3 QLFATINSTL(93102aa)抗原肽，是隐球菌MP 98中一个主要的HLAA*0201限制性CD8+CTL表位，可作为今后设计抗隐球菌多表位肽疫苗，进一步研究隐球菌打下一定基础。

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