人类8型疱疹病毒K8.1基因原核表达

　　作者：何方平, 王星，林仁勇，卢晓梅，冯晓辉，张亚楼，张跃新， 何斌 作者单位：中心实验室, 新疆乌鲁木齐830054

　　【摘要】 目的： 构建人类8型疱疹病毒(HHV8)K8.1基因原核表达重组质粒，获得HHV8外壳蛋白重组融合蛋白，为制备检测抗原建立平台。方法： 根据基因库K8.1全长基因序列和pET41a载体的多克隆位点设计引物，分别在引物两端添加特异酶切位点，以pGEMTeasy/K8.1质粒为模板，PCR扩增 K8.1基因全长序列，克隆入原核表达载体pET41a，构建原核表达质粒pET41a K8.1;转化大肠杆菌DH5α，经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性。结果: 酶切鉴定表明在约500 bp处可见酶切片段，测序结果表明构建的pET41aK8.1原核表达质粒连接正确，插入的K8.1 基因片断为494 bp。结论: 成功构建了pET41a K8.1原核表达质粒，为获得重组融合HHV8外壳蛋白建立了平台。

　　【关键词】 人类8型疱疹病毒; 原核表达; K8.1基因

　　Constructure prokaryotic expression plasmid of KSHV K8.1 geneHE Fangping, WANG Xing, LIN Renyong, et al

　　(Department of Infection, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University,

　　Urumqi 830054, China)

　　Abstracts： Objective： To construct the prokaryotic expression plasmid for pET41aK8.1. Methods： Using recombinant plasmid pGEMTeasy/K8.1 as the template, EcoR I and Xho I restriction digestion sites were amplified by PCR and subsequently inserted into prokaryotic vector, pET41a. The recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21(DE3) and then identified by double enzyme digesting and sequencing. Results： The insert target DNA was 494 pb, EcoR I and Xho I restriction digestion identified that there was DNA band at about 500 pb position, sequencing showing the insert DNA was connected correctly. Conclusion: Recombinant plasmid pET41aK8.1 is successfully constructed. Further study is needed to identify its immunity.

　　Key words: the human herpesvirus 8; prokaryotic expression; K8.1 gene

　　人类8型疱疹病毒( human herpesvirus 8 ，HHV8)又称卡波西肉瘤相关病毒(Kaposi′s sarcoma associated herpesvirus，KSHV)，于1994年由Chang等[1]在艾滋病合并Kaposi′s肉瘤患者的瘤组织中首次发现，属人类疱疹病毒家族的最新成员,是DNA肿瘤病毒[2]。HHV8检测方法的完善是目前热点研究领域之一，选择单一的HHV8检测抗原建立酶联免疫方法(ELISA)会导致检测的灵敏度下降，采用全病毒裂解态抗原建立的免疫荧光(IFA)法，会导致产生大量假阳性结果而影响检测的准确性，因此HHV8的检测抗原必须包括潜伏态表达抗原和裂解态表达抗原。目前，HHV8具有检测抗原应用前景的蛋白有代表病毒潜伏态的潜伏态相关核抗原(LANA1)、HHV8小包膜蛋白(ORF65)、壳膜蛋白(ORF K8.1)[3]。本实验室构建HHV8基因原核表达重组质粒，获得HHV8外壳重组融合蛋白，为制备检测抗原建立平台。

　　1材料与方法

　　1.1质粒、菌种与主要试剂、酶pGEMTeasy/K8.1质粒由美国芝加哥大学伊利诺医学院免疫与微生物系病毒中心实验室何斌教授惠赠，原核表达载体pET42a及大肠杆菌(E.coli)DH5α由本室保存。异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)购自Promega公司，限制性内切酶、PCR试剂盒、T4 DNA连接酶、DL2000、λHind Ⅲ DNA标志物均购自TaKaRa公司，其他生化试剂购自Sangon公司。

　　1.2原核表达质粒pET41aK8.1的构建

　　1.2.1PCR引物设计根据基因库K8.1全长基因序列和pET41a载体的多克隆位点设计引物。上游引物：5′CCG GAA TTC AGA TAC CAA CAA CAA CCG GT3′，下游引物：5′CCG CTC GAG TTA TGT CAT TTC CTG TGG AG3′，分别加入EcoR I和Xho I酶切位点，以上引物均由大连宝生物公司合成，下划线处为酶切位点。PCR反应总体积为50 μl,引物浓度为25 pmol/μl,扩增参数为94℃5 min，94℃ 50 s，58℃ 50 s，72℃60 s,30个循环后72℃延伸8 min。

　　1.2.2原核表达质粒pET41aK8.1的构建以pGEMTeasy/K8.1 质粒为模板，加入引物进行PCR扩增， EcoR I/Xho I双酶切K8.1 PCR产物和空质粒pET41a，连接并转化至大肠杆菌DH5α中，37℃培养，经卡那霉素抗性标记基因筛选得到阳性克隆，抽提质粒用于双酶切和测序鉴定。

　　1.2.3原核表达质粒pET41aK8.1的鉴定EcoR I、Xho I双酶切对重组质粒进行鉴定，酶切产物行凝胶电泳。酶切鉴定正确的pET41a K8.1质粒委托大连TaKaRa公司进行序列测定，运用DNAman软件及GenBank/BLAST对测序结果进行分析。

　　2结果

　　2.1质粒pET41aK8.1的构建与鉴定结果

　　凝胶电泳可见约500 bp的PCR扩增产物(图1)，pET41a K8.1重组质粒经EcoR I和Xho I双酶切鉴定可见大小约为500 bp的特异性片断(图2)。测序结果经DNAman软件及GenBank/BLAST对序列分析，正确率达99%以上，表明成功构建pET41a K8.1重组质粒。

　　3讨论

　　HHV8的血清检测方法有IFA法和ELISA法，裂解态IFA灵敏度高，但特异度低，目前已不主张该方法用于初筛，而潜伏态IFA检测又造成漏检现象。采用ELISA法时，选择检测抗原至关重要，因为HHV8潜伏态、裂解态各表达不同抗原，不同抗原在HHV8感染人群中表达率、表达水平、抗原性各有差异[4,5]。采用单一抗原建立ELISA法进行流行病学调查结果的准确度下降,漏检率升高，改进方法是采用组合抗原建立ELISA法进行检测，即分别选择HHV8潜伏态、裂解态表达的蛋白作为复合检测抗原，可以提高检测的灵敏度、特异度。K8.1基因编码HHV8外壳糖蛋白，属于裂解态晚表达抗原，是HHV8的独有抗原，与其他疱疹病毒不存在交叉反应。而且作为外壳蛋白，其检测的灵敏度明显高于LANA1和ORF65,在检测抗原组成上加入K8.1抗原，有利于提高检测方法的灵敏度。本实验通过双酶切鉴定及测序鉴定表明，人类8型疱疹病毒重组质粒PET41aK8.1制备成功，目标片段连接正确,但原核表达重组质粒的诱导及重组蛋白的抗原特异性则有待进一步研究验证。

　　【参考文献】

　　[1]Chang Y, Cesarman E, Pessin MS, et al. Identification of herpesviruslike DNA sequences in AIDSassociated Kaposi′s sarcoma[J]. Science, 1994,266:18651869.

　　[2]Baillargeon J, Deng JH, Hettler E, et al. Seroprevalence of Kaposi′s sarcomaassociated herpesvirus infection among blood donors from texas elsevier[J]. Science, 2001, 11(7):512518.

　　[3]Harutaka K, Iwasaki T, Nobuyoshi B,et al. Identification of antigenic proteins encoded by human herpesvirus 8 and seroprevalenc in the general population and among patient with and without Kaposi′s sarcoma[J]. Virology, 2000, (4):34783485.

　　[4]沈大为，石得仁，普雄明.经典型Kaposi′s肉瘤23例分析[J].临床皮肤病杂志，1993，22：136138.

　　[5]Dilnur P, Harutaka K, Wang ZH, et al. Classic type of Kaposi′s sarcoma and human herpesvirus 8 infection in Xinjiang, China[J]. Pathology International, 2001,51:845852.