COX-2在颜面皮肤癌中表达和肿瘤血管生成的研究

　　作者：李晓光，关善辉，张明宾，王延秀 作者单位：泰山医学院附属泰安医院，山东 泰安 271000

　　【摘要】 目的 探讨环氧化酶-2(COX-2)表达和颜面皮肤癌血管生成的关系。方法 免疫组化检测颜面皮肤癌COX-2、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、血管内皮生长因子(VEGF)表达，并测定肿瘤微血管密度(MVD)。结果颜面皮肤癌COX-2表达与VEGF、iNOS表达密切相关(P<0.05)。颜面皮肤癌COX-2表达阳性组和阴性组MVD有显著差异(P<0.01).结论 颜面皮肤癌COX-2表达和肿瘤血管生成有关，iNOS 和VEGF可能参与COX-2对肿瘤血管生成的促进作用。

　　【关键词】 颜面皮肤癌;环氧化酶;血管生成; 血管内皮生长因子; 诱导型一氧化氮合酶

　　Study of COX-2 Expression and Angiogenesis in Facial skin carcinoma

　　LI Xiao-guang ，GUAN Shan-hui，ZHANG Ming-bin, WANG Yan-xiu

　　Taian City Central Hospital，Taian 271000, China

　　Abstract：Objective: Propose To explore the relationships between COX-2 expression and angiogenesis in Facial skin carcinomaa.Methods: The COX-2 expression, iNOS and VEGF expression, MVD were evalulated by immunohistochemical method. Results: There was significant difference of MVD between COX-2 postive Facial skin carcinoma and negative ones(P< 0. 01).The expressions of COX-2 and iNOS、VEGF in Facial skin carcinomas were significantly positively correlated. Conclusions: The present findings suggest that there is some link between COX-2 and angiogenesis in Facial skin carcinoma, partly attributing to the effect of VEGF and iNOS.

　　Key words：facial skin carcinoma; cyclooxygenase; angiogenesis; vascular endothelial cell growth factor; inducible nitric oxide synthase

　　环氧化酶-2(cyclooxygenase—2 , COX-2)是炎症过程中一个重要的诱导酶。近年的研究表明，COX—2在多种肿瘤组织中过度表达，参与肿瘤的发生和发展[1,2],而肿瘤的生长依赖于血管生成，因此，COX—2与肿瘤血管生成的关系值得探讨。本研究采用免疫组化的方法检测颜面皮肤癌组织COX—2、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)的表达，计数肿瘤组织微血管密度(microvascular density, MVD)，探讨COX-2与iNOS、 VEGF及颜面皮肤癌血管生成的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 临床资料及切片制备

　　58例颜面皮肤癌组织均取自我院1984年～2004年手术切除标本蜡块，患者年龄31～81(平均51.2)岁，男32例，女26例。所有病人术前均未接受化疗或放疗，根据TNM国际统一分期法(UICC )进行临床分期，Ⅰ期17例，Ⅱ 期23例,Ⅲ期12例，Ⅳ期6例。组织学分级为1级27例，2级20例，3级11例。其中基底细胞癌35例，鳞状细胞癌23例。蜡块制备5μm厚连续切片，分别用抗VEGF单克隆抗体、第Ⅷ因子相关抗原抗体和 COX-2、iNOS多克隆抗体进行免疫组织化学染色，并做常规HE染色。

　　1.2 免疫组织化学染色

　　第一抗体COX-2、VEGF、Ⅷ因子相关抗原抗体(FⅧRAg)、iNOS均为武汉博士德公司提供，3,3-二氨基苯联胺(DAB)为Sigma公司产品，染色方法参照试剂盒说明按SABC法进行。分别用正常兔血清和0.01mol/L PBS液取代第一抗体作为替代对照和空白对照。用己证实 COX-2、VEGF、iNOS、和FⅧRAg染色阳性的乳腺癌切片作阳性对照。

　　1.3 COX-2、VEGF和iNOS的判断标准

　　肿瘤细胞内出现棕黄色颗粒为阳性，选择每张切片组织和细胞形态保持完整的组织区域进行免疫组化染色判断。根据纪小龙等[3]提供的免疫组化阳性判断标准,按肿瘤细胞着色强度及阳性细胞比例,以10%以上细胞呈弱、中等强度阳性反应为标准,分为阳性及阴性。

　　1.4 微血管计数判断标准

　　按照Weidner等[4]评判标准，计算肿瘤着色的毛细血管和微小血管，凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞群者作为一个血管计数，计数方法为每张染色切片选择3个血管最多的癌间质区，在200倍视野下进行血管计数，每例标本分别计数5个视野，取其平均值(图1)。

　　1.5 统计学处理

　　应用SPSS10.0软件进行数据处理，COX-2、VEGF、iNOS蛋白表达与MVD关系用t检验，COX-2、VEGF、iNOS蛋白表达间的关系用X2检验。

　　2 结 果

　　2.1 COX-2、VEGF、iNOS的表达与分布

　　①58例颜面皮肤癌组织中，有42例(72.41%)表达COX-2，COX-2阳性物质主要位于癌细胞的胞膜或胞浆(图2)。②有39例(67.72%)表达VEGF,VEGF阳性物质主要位于癌细胞的胞膜或胞浆(图3)，而且肿瘤组织的周边细胞染色要强于中心组织。变性坏死癌组织周边VEGF染色较强。部分肿瘤血管内皮细胞及新生小血管内皮也呈阳性。③有37例(63.79%)表达iNOS，阳性颗粒主要见于癌细胞胞浆内，为棕黄色,大多数为均匀着色,有的表现为小颗粒状(图4)。

　　2.2 COX-2的表达与颜面皮肤癌VEGF、iNOS及 MVD的关系(表1)

　　58例颜面皮肤癌COX-2、VEGF均阳性的32例中平均MVD为38.2±5.9，而均阴性的9例为30.9±5.6 (t=3.31,P<0.01)，COX-2、iNOS均阳性的31例中平均MVD为37.1±6.4，而均阴性的10例为28.4±5.8(t=3.82 ,P<0.01)，表明COX-2与VEGF、iNOS均阳性的颜面皮肤癌组织MVD明显高于两者均阴性者。表1 58例颜面皮肤癌组织COX-2表达与VEGF、iNOS及MVD的关系(略)

　　3 讨 论

　　环氧化酶(cyclooxygenase;COX)，又称环氧酶、前列腺素合酶等，是控制前列腺素类化合物产生的重要限速酶。细胞膜的磷脂在磷脂酶的作用下水解出花生四烯酸，在环氧化酶的作用下，花生四烯酸可转变为前列腺素(Prostglandin,PGs)而发挥多种生物学作用。其以同源二聚体形式存在于哺乳动物的微粒体中，分子量为7000道尔顿。该酶有两种异构形式：COX-1和COX-2。COX-1为结构型酶，在正常情况下持续产生PGs，维持机体的生理过程。COX-2属于诱导型酶，可被多种刺激因素上调，如生长因子(EGF、PDGF、TGF)、细胞因子(IL-1、TNFX)、促腺瘤剂、癌基因、内皮素(ET)等。COX-2不仅在肿瘤细胞中表达，而且在原发或转移肿瘤组织的新生血管内皮细胞中也呈高表达。应用选择性COX-2抑制剂celecoxib可显著抑制实验小鼠转移瘤的血管生成[5]，敲除COX-2基因的实验动物肿瘤组织血管密度下降，肿瘤生长明显减慢，提示COX-2与肿瘤血管生成关系密切[6]。本研究发现COX-2表达阳性组与阴性组间MVD差异显著(t=5.77 ,P<0.01)，提示COX-2表达和颜面皮肤癌血管生成有关。

　　VEGF是已知的最强有力的血管生成因子，而其他血管生成因子的血管生成作用是全部或部分通过增强VEGF的表达及生成作用来实现的[7]。VEGF其本质是一种高度特异的血管内皮细胞分裂素，其主要生物学功能为:促进不同来源内皮细胞分裂增殖和血管构建以及升高血管尤其是微血管的渗透性;它通过改变内皮细胞基因活化的形式，上调uPA, tPA以及PAI-1表达，诱导内皮细胞表达蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因子，从而促进血管生成[8]。

　　有资料证实COX-2可使肿瘤中VEGF表达上调，抑制COX- 2则可抑制VEGF的表达。COX-2表达导致其酶解产生前列腺素PGE2升高，PGE2可以更直接促进VEGF表达上调。转染COX-2基因的CaCo-2结肠癌细胞株，在体外使VEGF的生成量比未转染的细胞株增加了4～8倍，而COX-2抑制剂可使VEGF的量恢复到基础水平[9]。将PC-3前列腺癌细胞株接种于裸鼠，用选择性COX-2抑制剂NS-398处理后，VEGF表达明显下调[10]。本研究中COX-2表达阳性的颜面皮肤癌VEGF表达率比阴性组明显增高(P<0.05),COX-2与VEGF表达呈显著正相关，COX-2 、VEGF均表达阳性的颜面皮肤癌组织MVD明显高于两者均阴性者(P<0.01)，以往的研究表明VEGF对颜面皮肤癌血管生成具有促进作用[11],由此推测,COX-2可能通过诱导VEGF表达上调参与颜面皮肤癌血管生成，而VEGF可能是COX-2诱导颜面皮肤癌血管生成的最重要介质。

　　iNOS也是一种诱导表达的酶，COX-2与iNOS常协同参与机体内的一些生理和病理过程，体外研究已表明，NO是COX-2表达及活性的重要调节因素，而前列腺素也能影响iNOS的表达[12]。本实验中检测到COX-2表达阳性的颜面皮肤癌,iNOS表达率比阴性组明显增高,COX-2与iNOS表达呈显著正相关(P<0 .05)，表明它们在颜面皮肤癌发生发展中具有协同作用。

　　最近有研究表明，由iNOS诱导生成的NO通过激活COX-2的活性来促进血管的生成[13]。另有研究表明，NO在VEGF诱导肿瘤血管生成的每一步骤均起重要作用[14]。Rao等[15]联合应用iNOS的抑制剂SC-51和COX-2的选择性抑制剂Celecoxib比单独应用二者更能有效的阻止结肠粘膜上COX-2。以往的研究表明iNOS对颜面皮肤癌血管生成具有促进作用[11],本研究结果显示, COX-2 、iNOS均表达阳性的颜面皮肤癌组织MVD明显高于两者均阴性者(P<0.01)，因而我们认为，iNOS和COX-2在肿瘤的血管生成中可能起协同作用。

　　综上所述，颜面皮肤癌组织中存在COX-2高表达，COX-2可能通过诱导VEGF表达而促进颜面皮肤癌血管形成，iNOS和COX-2起协同作用，进而促进颜面皮肤癌的生长。COX-2、iNOS和VEGF抑制剂在颜面皮肤癌的治疗中具有潜在的应用价值。

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