银屑病病人外周血单核细胞TLR2基因表达及血清ASO和IL8水平变化

　　作者：崔艳霞 王桂芝 作者单位：青岛大学医学院附属医院皮肤科,山东 青岛 266003

　　【摘要】 目的 观察寻常型银屑病病人外周血单核细胞Toll样受体2(TLR2)mRNA表达及血清抗链球菌溶血素“O”(ASO)和白细胞介素8(IL8)水平的变化,探讨其与银屑病发病的关系。方法 采用RTPCR方法检测银屑病病人(银屑病组)外周血单核细胞TLR2 mRNA表达,采用胶乳凝集法检测血清ASO水平,采用ELISA法检测血清IL8水平。以我院体检健康者30例作为对照(正常对照组)。结果 银屑病组TLR2 mRNA表达明显高于正常对照组(t=5.541,P<0.01);银屑病组点滴型与斑块型TLR2 mRNA表达比较无显著性差异(t=0.318,P>0.05)。银屑病组血清ASO水平明显高于正常对照组(χ2=8.604,P<0.01);且点滴型病人明显高于斑块型病人(χ2=9.780,P<0.01)。银屑病组血清IL8水平显著高于正常对照组(t=28.463,P<0.01);点滴型与斑块型病人之间比较无显著性差异(t=0.660,P>0.05)。点滴型病人ASO阳性者TLR2 mRNA表达水平高于ASO阴性者,差异有显著性(t=2.407,P<0.05);银屑病病人外周血TLR2 mRNA表达与IL8水平呈正相关(r=0.637,P<0.01)。结论 TLR2可能通过识别链球菌等入侵病原微生物启动机体免疫应答,介导细胞因子IL8等的产生,参与银屑病皮损的发生和发展。

　　【关键词】 银屑病 Toll样受体2 抗链球菌溶血素 白细胞介素8

　　STUDY OF TLR2 GENE EXPRESSION AND LEVELS OF ASO AND IL8 IN PERIPHERAL BLOOD OF PSORIATIC PATIENTSCUI YANXIA, WANG GUIZHI (Department of Dermatology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) [ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression of tolllike receptor 2 (TLR2) mRNA in monocytes of psoriatic patients’ blood and the serum levels of interleukin8 (IL8) and antistreptolysin O (ASO), and to explore their relevance to pathogenesis of psoriasis.MethodsExpression of TLR2 mRNA were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) method; serum levels of ASO and IL8 were detected by latex agglutination assay and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) respectively. ResultsExpression of TLR2 mRNA of the patients was higher than that of the controls (t=5.541,P<0.01). There was no significant difference in the expression of TLR2 mRNA between guttate and plaque psoriatic patients (t=0.318,P>0.05). The positive rate of ASO in the patients was higher than that of the controls (χ2=8.604,P<0.01); and the ASO positive rate in guttate patients was higher than that in plaque psoriatic patients (χ2=9.780,P<0.01). Level of IL8 in psoriatic patients was higher than that controls (t=28.463,P<0.01); there was no significant difference between guttate and plaque psoriatic patients (t=0.660,P>0.05). The expression of TLR2 mRNA in psoriatic patients with positive ASO was higher than that in patients with negetive ASO (t=2.407,P<0.05); the expressions of TLR2 mRNA and IL8 in psoriatic patients had a positive correlation (r=0.637, P<0.01). ConclusionTLR2 may be involved in the occurence and development of psoriasis by recognizing the invading streptosis and the following generation of cytokines.

　　[KEY WORDS]psoriasis; tolllike receptor 2; antistreptolysin; interleukin8

　　银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，与遗传和环境因素有关，其病因和发病机制尚未完全明确，目前多认为是一种T细胞介导的免疫失衡性疾病。有研究表明，细菌、真菌、病毒等微生物感染与银屑病的发生和发展有密切关系，并认为银屑病是一种皮肤抵抗病原微生物的防御性表现[1]。近年来，Toll样受体(TLR)在感染性疾病及银屑病中的作用引起国内外有关专家的广泛关注[2,3];已有研究表明，IL8可促进银屑病的炎症浸润，介导皮损的发生和发展[4]。银屑病病人TLR2基因表达国外多集中于对角质形成细胞(KC)的研究，尚未见银屑病病人外周血单个核细胞TLR2基因表达，以及关于感染与TLR2基因表达及IL8水平关系的相关报道。本文采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法检测银屑病病人外周血单个核细胞TLR2基因表达水平，并分别采用胶乳凝集法和酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清抗链球菌溶血素“O”(ASO)和白细胞介素8(IL8)水平，探讨其与银屑病发病的关系，从而为阐明感染诱发或加重银屑病提供分子水平的证据。

　　1 资料和方法

　　1.1 一般资料

　　银屑病病人(银屑病组)均为我院门诊皮肤科病人，具有典型皮损，临床诊断明确。其中，点滴型银屑病病人30例，男16例，女14例;年龄17～60岁，平均33.13岁;病程1周～1.5月;发病前1周～1月有发热、咽喉肿痛或其他上呼吸道感染症状。斑块型银屑病病人20例，男9例，女11例;年龄18～63岁，平均34.5岁;病程3月～10年;所有病人观察前1月未接受系统治疗，且不伴有其他急慢性疾病。对照组30例，为来我院体检的健康人，男女各15例;年龄19～64岁，平均36.24岁;近1月内均无发热、咽喉肿痛等明显上呼吸道感染症状，且不伴有其他急慢性疾病。

　　1.2 标本收集

　　常规消毒皮肤后，抽取外周静脉血5 mL，其中2 mL枸橼酸钠抗凝，用于TLR2 mRNA的检测;其余3 mL置试管中，待血块收缩后以2 500 r/min离心分离血清，分装后置-20 ℃冰箱保存，分别用于ASO、IL8水平检测。

　　1.3 TLR2 mRNA表达检测

　　以小量血液总RNA抽提试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)提取外周血中总RNA，紫外分光光度计(DU640,美国Beckman公司)测定其纯度和含量，取RNA样本2 μg采用一步法RTPCR检测TLR2 mRNA表达，以β肌动蛋白(βactin)为内参照。引物(上海生工生物工程技术服务公司合成)序列为：TLR2正义：3′GCCAAAGTCTTGATTGATTGG5′，反义：3′TTGAAGTTCTCCAGCTCCTG5′，产物长度为347 bp;βactin正义：3′ACGTCTGCTGGAAGGTGGAC5′，反义：3′GGTACCACCATGTACCCAGG5′，产物长度为168 bp。

　　1.4 扩增产物检测

　　PCR扩增完毕后，每个反应体系取产物2 μL，于20 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳，在紫外线透射凝胶成像仪(VilberLourmat，France)中分析电泳带的灰度值，以TLR2/βactin记录结果，作为TLR2 mRNA的相对表达水平。

　　1.5 ASO检测

　　采用胶乳凝集法(试剂为北京利德曼生化有限公司生产的ASO胶乳试剂)，以ASO>2×105 kU/L为阳性。

　　1.6 血清IL8水平测定

　　采用双抗体夹心ELISA法(试剂盒为Biosource ELISA kit，北京中昊时代生物技术分装)。具体操作严格按试剂盒说明书进行，即刻测量标本在492 nm波长处吸光度值，并根据标准曲线查出其浓度。

　　2 结 果

　　银屑病组TLR2 mRNA的表达水平显著高于正常对照组，差异有统计学意义(t=5.541,P<0.01);点滴型组与斑块型组比较差异无显著性(t=0.318,P>0.05)。银屑病组ASO阳性率明显高于正常对照组，差异有显著性(χ2=8.604,P<0.01);点滴型组明显高于斑块型组，差异亦有显著性(χ2=9.780,P<0.01)。银屑病组IL8水平显著高于正常对照组，差异有显著性(t=28.463,P<0.01);点滴型组与斑块型组相比差异无显著意义(t=0.660,P>0.05)。点滴型银屑病病人ASO阳性者TLR2 mRNA表达水平(1.020±0.152)明显高于ASO阴性者(0.871±0.186)，差异有显著意义(t=2.407,P<0.05);银屑病病人外周血单个核细胞TLR2 mRNA表达与血清IL8水平呈正相关(r=0.637,P<0.01)。见表1。表1 各组TLR2 mRNA表达及ASO、IL8检测结果比较

　　3 讨 论

　　3.1 TLR2与银屑病的关系

　　TLR是一新的蛋白家族，是机体通过感知病原微生物直接做出防御反应的天然免疫受体，可启动天然免疫反应和影响后继的获得性免疫反应[2]，成为天然免疫和获得性免疫之间的桥梁。TLR中与银屑病关系密切的主要是TLR2。以往对TLR2与银屑病关系的研究，主要来自对皮肤KC的观察。

　　BAKER等[3]采用免疫染色法研究显示，TLR2在正常皮肤表皮基底细胞高度表达，而在银屑病病人皮损处表皮基底细胞中度表达，在表皮上部KC高度表达。已有研究表明，银屑病皮损中细菌、真菌等的定植明显高于正常皮肤，因此，TLR2在表皮上层表达上调可能是角蛋白对病原微生物存在的反应。

　　已有研究表明，银屑病病人皮损中存在TLR2基因表达上调，但尚未见血液中单个核细胞TLR2基因表达与银屑病关系的相关报道。本实验采用高敏感性的RTPCR方法对银屑病病人外周血单个核细胞TLR2 mRNA表达进行研究，结果显示，银屑病组TLR2 mRNA表达显著高于正常对照组，差异有显著性，提示银屑病的发生、发展过程中也存在外周血单个核细胞TLR2基因表达上调。

　　3.2 链球菌感染与银屑病的关系

　　链球菌感染人体后，体内可产生抗ASO抗体。本研究结果显示，银屑病组ASO阳性率明显高于正常对照组，差异有显著性，提示寻常型银屑病的发生或发展与链球菌感染有关;点滴型病人ASO阳性率亦高于斑块型病人，两组之间有显著性差异;点滴型病人ASO阳性者TLR2 mRNA表达水平高于ASO阴性者，提示链球菌感染可能通过诱导TLR2基因表达上调，活化TLR信号转导通路，从而介导银屑病皮损的发生。

　　点滴型银屑病病人发病前均有不同程度的上呼吸道感染症状，提示可能存在链球菌感染;而斑块型银屑病病人无明显上呼吸道感染史，而统计学分析显示两组间TLR2 mRNA表达无显著性差异[5]。据此我们推测链球菌感染可能在点滴型银屑病的发病过程中起重要作用，而斑块型银屑病可能与其他真菌、细菌、病毒感染的关系更为密切，如马拉色菌及金黄色葡萄球菌、HIV等[6，7]，但确切原因还有待于进一步研究。

　　3.3 IL8与银屑病的关系

　　IL8是一种重要的多元性炎症细胞趋化因子，主要来源于活化的单核细胞、巨噬细胞、部分CD+4T淋巴细胞、血管内皮细胞、KC等多种细胞。有研究显示，银屑病病人皮损处KC表达IL8及其受体明显高于正常对照组，并认为这可能与银屑病病人皮损局部表现出的KC高度增殖有关[4];也有文献认为，血清中IL8水平明显升高[8]。本文结果显示，银屑病病人血清IL8水平明显高于正常对照组，差异有显著性，这与以往研究结果一致;银屑病病人外周血单个核细胞TLR2基因表达与血清IL8水平呈正相关，提示TLR2可能介导了病原微生物诱导的细胞因子IL8分泌，继而IL8通过趋化炎症细胞至皮损局部和促使KC高度增殖而表现出银屑病特有的临床及病理症状。

　　综上所述，TLR2可能通过识别病原微生物感染参与银屑病皮损的发生，而IL8可能是参与银屑病皮损形成的重要细胞因子。病原微生物可引起外周血单个核细胞TLR2基因表达上调，启动天然免疫应答，进而影响后继的获得性免疫应答，参与银屑病免疫、炎症反应，最终可能导致银屑病皮损的发生和发展。对TLR2的进一步研究，将有助于阐明银屑病的病因和发病机制，从而为临床提供更加积极有效的预防及治疗措施，并将为抗TLR2单克隆抗体的制备及应用提供可能的理论依据。但有关感染与银屑病的关系及TLR在银屑病发病中的作用还有待于进一步研究。

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