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作者：赵淑芹    作者单位：枣庄市立三院，山东 枣庄 277100【摘要】  目的 探讨精子顶体酶活性的变化与体外受精（IVF）受精率的关系。方法 46 例不育夫妇男方精液，测定其密度、活力、前向运动精子及精子顶体酶活性，探讨与IVF受精率的相关性。结果 精子顶体酶活性与精子的密度无相关性，与精子的活率和前向运动精子有正相关，精子顶体酶活性与IVF 受精率有直线正相关性。结论 精子顶体酶活性与IVF受精率有相关性，通过测定精子顶体酶活性可能预测IVF受精率。

【关键词】  顶体酶活性；IVF；受精率

 Study on the relationship between sperm acrosin activity

    and insemination during invitro fertilizationZHAO Shuqin

    （The Third Hospital of Zaozhuang，Zaozhuang 277100, China）

    Abstract:Objective: To study the effect of sperm acrosin activity and its association with the fertilization rate of IVF. Methods: The sperm acrosin activity was assessed from the semen specimens in the male partners from 46 infertility couples selected for IVF. Sperm acrosin activity was determined spectrophotometrically to test the sperm acrosin activity，density,  vitality. The sperms that moved forward were counted and their association with fertilization of the IVF was then studied. Results: The sperm density did not affect sperm acrosin activity in the study. Sperm acrosin activity was associated with sperm vitality and the forwardmoving, which was also positively related with fertilization rate of the IVF. Low acrosin activity was associated with low fertilization rate. Conclusion: Sperm acrosin activity is associated with fertilization rate of the IVF, which can be a tool to predict the fertilization rate of the IVF.

    Key words:sperm acrosin activity; IVF; fertilization rate of IVF

    顶体酶是一种丝氨酸蛋白水解酶，位于精子头部顶体内膜上，能结合于透明带的糖蛋白上，在发生顶体反应之前无活性的顶体酶前体就已经存在于双层顶体膜之间。在精子与透明带结合时，立即发生顶体反应，顶体酶原活化成为顶体酶消化局部透明带，使精子穿过透明带，最终与卵子融合。尽管一些研究都不同程度地报道精子顶体酶与透明带间的相互作用［13］，但有关精子顶体酶与透明带结合的分子机制目前还不清楚。本研究拟探讨常规体外受精—胚胎移植（IVFET）中精子顶体活性和IVF受精率之间的关系，为选择IVF 还是卵浆内单精子注射（ICSI）提供实验依据。

　　1  对象与方法

    1.1  研究对象  选自2005 年1月～12月IVF 治疗的46例不育夫妇，女方年龄24～46 岁，平均年龄33岁；男方年龄27～50岁，平均年龄34岁；不育年限2 ～11年。 46例不育夫妇中, 输卵管因素者39例（84.8%），轻度弱精子症者3例（6.5%）， 不明原因性不孕2 例（4.3%），排卵障碍者1 例（2.2%），子宫内膜异位者1例（2.2%）。男方精液均达到IVF 标准且精子数目满足试验要求，即：精子计数≥ 10×106/ml。促排卵周期得到正常成熟卵子5个以上。按照卫生部2003年颁布的《人类辅助生殖技术规范》计算卵子受精率。

    1.2  精液的收集  男方取精前禁欲3～5 d，以手淫法完整收集精液于无菌无毒取精杯中，立即放置于37 ℃水浴箱中，半小时后待其自然液化后检测。

    1.3  试验方法

    1.3.1  精子顶体酶活性定量检测

    1.3.1.1  试剂  试剂组成:抑制剂，缓冲液，终止液，底物液。临用前配制反应液。方法是:按体积比取底物液1份，加缓冲液4份，充分混匀。配制反应液前，底物液、缓冲液必须置室温平衡，否则新配制的反应液遇冷易形成沉淀:先加底物液，再缓慢加入缓冲液，且边加边混合溶液，以免形成沉淀:该溶液刚配制完毕，溶液中可能会出现细小颗粒，应待其完全溶解，一旦溶解完全应立即使用。

    1.3.1.2  实验设备  721型分光光度计，低速自动平衡离心机，24 ℃电热恒温水浴箱，精密移液器，石英定时钟，0.5  cm厚度玻璃比色皿，一次性吸嘴，棕色空瓶(配反应液用)，Eppendorf管(1.5 ml/支)。

    1.3.1.3  实验原理

    精子顶体内存在精氨酸酞氨酶，其活性可反应顶体酶全部活性。精氨酸酞氨酶以Na苯甲酞—DL精胺酸—P硝酞基苯胺(BAPNA)为底物，分解产生有色产物——硝酞基苯胺，通过测定该产物量可推算出精氨酸酞氨酶的活性。

    1.4  实验步骤

    每份标本同时设测定管和空白管，每管反应的精子数为7.5×106 个，各管2000 g 离心20 min，倾倒弃去精浆后，加入抑制剂100 μl, 以去除精浆蛋白酶抑制因子，于测定管和对照管各加入反应液1000 μl，然后在对照管中加入终止液100 μl，24 ℃准确孵育1 h；1 h 后在测定管中加入终止液100 μl，终止反应后，将测定管和对照管2000 g离心15 min，上清液移入0.5 cm比色皿，410 nm波长比色，蒸馏水调零，读取各管OD值，根据公式：顶体酶活性=（测定管OD值-对照管OD值）×106 /247.5×7.5，计算每106 精子的总顶体酶活性。

    1.5  促排卵及卵母细胞收集

    46 例女方采用长方案，于月经周期第21天采用GnRHa 降调节，选择适当剂量的FSH 促排卵，当至少有3个卵泡的平均直径＞16 mm或两个卵泡平均直径＞18 mm时,适时注射HCG 10，000 IU,36 h后在B 超( SSD21100型,探头频率5 MHz , ALO KA ,日本) 引导下经阴道取卵,穿刺针( K2OPSD216352B2ET 型,COO K,澳大利亚) 长35 cm ,16 号。解剖显微镜下寻找卵—冠—丘复合物（OCCCs）。根据卵—冠—丘复合物(OCCCs) 进行卵细胞分级:Ⅰ级:放射冠致密,卵丘细胞密集,卵细胞内无生殖泡、无第一极体(不成熟卵) ;II级:放射冠呈放射状排列,卵丘大、松散,见第一极体,可以直接受精(成熟卵) ; III级: 卵细胞充分暴露,放射冠散落,卵丘充分延伸或解体,受精能力低下(过度成熟卵)。取卵日收集精液标本,采用Puresperm 梯度离心法优化处理用于授精，授精方式均选用常规IVF。适时观察卵子受精率。按照卫生部2003年颁布的《人类辅助生殖技术规范》计算卵子受精率。

    1.6  统计学处理

    将数据录入微机，采用Excel和PEMS 3.1统计软件处理。精子密度、活率、活力（a+b）、顶体酶活性与受精率进行直线相关分析。

    2  结  果

    2.1  总体受精率  本研究46例患者共获卵425枚，受精274枚，受精率64.47%。

    2.2  精子顶体酶活性与受精率(%)的关系  精子顶体酶活性与受精率呈直线相关关系，r=0.6954（t=4.7406,  P=0.0001）；直线回归方程为:y=32.6208+0.3727x(F=22.4733,P=0.0001)。见图1。

    图1  精子顶体酶活性与IVF受精率回归曲线

    2.3  密度与顶体酶活性的关系  密度与顶体酶活性无直线相关关系，r= 0.2787 （t=1.4215, P=0.1680）。    

    2.4  顶体酶活性与前向运动精子的关系  顶体酶活性与前向运动精子呈直线相关关系，r= 0.541（t=3.1515, P=0.0043）。

    3  讨  论

    精子顶体蛋白酶，又称为顶体素。它主要位于精子头部的顶体基质和内膜上，本质为一种糖蛋白，是一种特殊的精子丝氨酸蛋白溶解酶［4］。精子顶体酶的合成是随着顶体的形成而进行，以无活性的酶原形式存在，称为前顶体酶，在精子获能和精子与透明带结合发生顶体反应时，顶体内的pH值升高，前顶体酶能自动活化，降解为顶体酶 ［5］。所有哺乳动物的卵母细胞周围都包围着细胞外基质—透明带，在精子与卵母细胞作用的早期阶段，精子需与透明带相互识别，精子识别并穿透卵母细胞透明带是哺乳动物受精过程的关键。精子顶体酶具有蛋白水解活性，Yamagata等［6］的研究认为它能消化透明带糖蛋白帮助精子穿透透明带，并在顶体反应过程中调节顶体内容物的释放。

    Nayernia ［7］等认为精子顶体酶活性是反映男性生育力的功能指标，较低的精子顶体酶活性可能与男性的生育力低下和不育有关。Nakagawa等发现弱精症患者以及不明原因不育病人，精子顶体酶活性降低。Mari［8］等发现各项精液参数正常的不明原因不育男性约有19%表现为精子顶体酶活性异常，本研究采用改良的Kennedy 法检测精子顶体酶活性，结果证明，精子顶体酶活性与IVF 受精率有相关性，在本研究中IVF 平均受精率为(64.4681±38.9252)%。本研究进一步分析精子顶体酶活性与IVF 受精率的关系，发现精子顶体酶活性与IVF 受精率具有直线相关性，采用直线回归分析，建立回归方程: y=32.6208+0.3727x（其中x表示精子顶体酶活性,y 表示精子受精率），该方程检验具有统计学意义。根据回归方程计算，精子顶体酶活性＜ 57.8 mIU/106 精子时，提示IVF 受精率低于30% 的敏感度为66.7%，特异度为98.0%，此结果较所给定的精子顶体酶活性的正常值48.2 mIU/106 精子稍高，精子顶体酶活性＞ 86.604 mIU/106 精子时，提示受精率高于65% 的敏感度为85%，特异度为79%。据此，较低的精子顶体酶活性可以反映男性不育的某一方面，但在常规的精液分析中并不能得到诊断。因此在某些病例，精子顶体酶活性是一个有用的附加的精液指标,能帮助我们预测IVF 治疗中获得胚胎的机会。

    本研究认为，在准备接受辅助生殖技术治疗的病人，当精液各项参数达到常规IVF 标准时仍有必要了解精子顶体酶活性，顶体酶活性正常时应考虑选择IVF，而各项精液参数正常但精子顶体酶活性低的病人可以考虑选择部分ICSI 治疗，以提高受精率，降低IVF过程中低受精率的风险。

【参考文献】  ［1］ 段红艳. 精子顶体蛋白酶与生殖的研究进展［J］.中国男科学杂志，2006，4：3135.

［2］ Tambe AS, Kaore SB, Sawane MV, et al. Indian J Med Sci, 2001，55(3): 125132.

［3］ 郝运申. 男性不育患者精子顶体酶活力测定［J］.中国实验临床免疫学杂志,1991 ,3 (2) :372391.

［4］ Howes L，Jones R. Interactions between zona pellucida glycoproteins and sperm proacrosin/acrosin during fertilization［J］.J Repro Immunol, 2002，53(12):181192.

［5］ Honda A, Siruntawineti J, Baba T. Role of acrosomal matrix proteases in spermzona pellucida interactions［J］. Hum Reprod Update, 2002，8(5): 405412.

［6］ Yamagata K, Murayama K, Okabe M, et al. Acrosin accelerates the dispe rsal of sperm acrosomal proteins du ringacrosome reaction［J］. J Biol Chem, 1998，273(17): 1047010474.

［7］ Nayernia K, Adham IM, Shamsadin R, et al. Proacrosin deficient mice and zona pellucida modifications in an experimental model of multifactorial infertility［J］. Mol Hum Reprod, 2002，8(5): 434440.

［8］ MscleodJ,LoyceC,BeylerSA,et al.Semen quality in one thousand men of known fertility and eight hundred cases of infertile marriage［J］. FertilSteril,1951,2:115119.