钙和钙结合蛋白与皮肤分化和损伤修复

钙和钙结合蛋白与皮肤分化和损伤修复作者：王志玲 王秀卿 勾凌燕    作者单位：050081 石家庄 白求恩军医学院    【关键词】  钙； 钙结合蛋白； 皮肤分化皮肤是机体抵御脱水、损伤和感染的第一道防线。    哺乳动物皮肤由表皮、真皮和皮下结缔组织及皮肤附件等构成［1］。钙离子和钙结合蛋白在皮肤分化和损伤修复中发挥了重要作用。1  钙离子    钙离子(Ca2+)作为普遍存在的胞内信使影响许多生理过程，如增殖、发育和肌肉收缩等。Ca2+在哺乳动物皮肤的正常更新中，充当角质细胞增殖和分化的调节物。体外培养的小鼠角质细胞，在低Ca2+浓度(0.05 mM)下，保持增殖活性；在高Ca2+浓度(0.1 mM)下，停止增殖，开始分化并诱导谷氨酰胺转移酶(transglutaminase)、外皮蛋白(involurin，IVN)、兜甲蛋白(loricrin)和profilaggrin表达［2］。体内试验也表明新生和成年无毛小鼠表皮存在Ca2+梯度。提示胞内Ca2+浓度的变化可以调节表皮分化。破坏表皮通透性可以改变皮肤Ca2+梯度［3］。Ca2+还在皮肤损伤修复的不同时期发挥作用。在止血期，Ca2+作为凝血因子Ⅳ，促进合成和释放凝血因子Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ，使凝血酶原转变成凝血酶［2］。应用CaCl2处理豚鼠背部开放伤创面，可以使颗粒组织和颗粒组织中钙调素的量明显增加。提示Ca2+在创面愈合早期颗粒组织形成过程中有明显作用，这种作用可能是通过Ca2+calmodulin系统实现的［4］。观察藻酸钙对体外培养的人真皮成纤维细胞、微血管内皮细胞(HMEC)和角质细胞增殖、迁移和毛细血管样结构形成的影响，发现藻酸钙可以促进成纤维细胞增殖、抑制HMEC和角质细胞增殖；抑制成纤维细胞迁移，但不影响角质细胞迁移；对HMEC形成毛细血管样结构没有明显影响。藻酸钙对增殖和迁移的影响可能是由释放的Ca2+介导的，可以改善正常创面愈合的一些细胞功能［5］。2  钙调素    钙调素(CaM)是由148个氨基酸残基组成的酸性小分子蛋白，分子量为16.7 kDa，有4个钙结合位点，呈典型的EF手形结构。CaM与Ca2+结合后构象变化，疏水区暴露，可以结合靶蛋白。CaM可以调节角质细胞增殖和分化，体外培养的高增殖性角质细胞和银屑病角质细胞CaM水平显著增高［5］。人的烧伤渗出液中存在CaM，其浓度比血清CaM浓度高3倍，用CaM抑制剂或抗CaM抗体抑制烧伤渗出液中CaM的活性，可显著降低其对角质细胞、成纤维细胞的有丝分裂活性，推测烧伤渗出液(包含CaM)可能有助于烧伤皮肤的愈合［6］。此外，在表皮的桥粒鉴定出一种CaM结合蛋白(desmocalmin)，还发现CaM可以调节人血小板谷氨酰胺转移酶活性(factor XIII)［5］。3  钙调素样蛋白(calmodulinlike protein,CLP)    CLP是由位于人10p13染色体上一个无内含子基因编码的，可能是一种被表达的反转座子。最早被认为是一种无内含子人钙调素样假基因，其开放阅读框包括444个核苷酸。阅读框的核酸序列和已知的三种人钙调素cDNA，λht6、Hcwp和λhCE1的序列同源性分别为80%、71%和69%。氨基酸序列和脊椎动物CaM同源性为85%。有4个可能的钙结合功能区［7］。后来发现CLP可在前列腺、乳腺、子宫颈和皮肤上皮中表达［8］。在无限增殖的乳腺上皮细胞系、所有的乳腺肿瘤细胞系和大约80%人乳腺肿瘤组织中，CLP表达下调［9］。CLP在分化的复层上皮表达增加，免疫染色可以看到CLP表达从基层、棘层到颗粒层逐渐增强。影响角质细胞分化的因子，如EGF和KGF，可以影响体外培养的正常人角质细胞CLP的表达。调节EGF受体信号通路的因子对调节CLP表达效果明显。提示CLP的表达可能受人角质细胞等上皮细胞终末分化过程的调节并且和该过程有关。hCLP还可与人非经典的肌球蛋白X(noncanonical myosin X)结合［10］。4  钙调素样皮肤蛋白(calmodulinlike skin protein，CLSP)    人CLSP属于钙调素家族成员。由146个氨基酸残基组成，分子量为15.9 kDa，有4个钙结合位点。与人CaM比较，同源性为52%。在表皮特异性表达，与表皮分化相关。CaM能激活表皮蛋白钙调磷酸酶(calcineurin)，而CLSP对其没有激活作用，提示这两种蛋白功能不同。应用CaM和CLSP亲和层析，对人皮肤蛋白提取物中蛋白进行分析，发现两者结合的蛋白从质和量上都有区别。CLSP和谷氨酰胺转移酶3(transglutaminase 3，TGase)结合，TGase是一种钙依赖的酶，是表皮分化中主要的酶，在分化后期表达，通过γ谷氨酰赖氨酸异肽键交联结构蛋白形成角质层。提示CLSP可能在角质细胞分化后期起调节作用［8］。另外，S100蛋白是TGase催化的靶蛋白，hClsp也可能调节真皮中S100蛋白的功能［10］。5  皮肤钙调素相关因子(skin calmodulinrelated factor，Scarf)    皮肤钙调素相关因子属于钙调素样钙结合蛋白(CaMlike Ca2+binding protein)家族成员。Scarf与CaM样钙结合蛋白基因具有同源性，特异性表达在表皮分化的角质细胞中。Scarf2是一个与Scarf高度相关的基因。Scarf开放阅读框编码一个由148个氨基酸残基组成的蛋白，分子量16.7 kDa，含有4个结合钙离子的EF手形结构域。Scarf的Ca2+结合区提示，它可能通过调控Ca2+介导的信号途径在表皮分化调节中起作用。Scarf与鼠CaM、人CaM样蛋白和人CaM样皮肤蛋白序列相似性分别为56.7%、64.2%和64.9%。Scarf mRNA在胚胎育期表皮的全层分化细胞均有表达。在新生鼠表皮开始分化的棘细胞和颗粒细胞层也有表达。Scarf的表达依赖PKC信号途径［10］。应用亲和层析和质谱相结合的方法，鉴定出一些与Scarf结合的蛋白分子，1433蛋白(1433 s)、膜联蛋白(annexins)、钙网蛋白(calreticulin)、内质网蛋白72(endoplasmic reticulum protein 72，ERp 72)和核仁蛋白(nucleolin)。应用急性表皮破坏方法改变表皮的钙梯度，可使Scarf、annexins、calreticulin和ERp 72表达上调，1433s和nucleolin表达下调。因为annexins、calreticulin、和ERp 72与Ca2+诱导的细胞运输有关，包括片状小体分泌和钙平衡，Scarf与这些蛋白的相互作用可能在皮肤屏障重建方面起作用。另外，1433s和nucleolin表达下调可能在角质细胞分化和生长抑制过程中起作用。对人创面愈合过程中Scarf的定位、表达和与靶蛋白结合进行研究发现，伤后第4天和第7天伤口边缘表皮中Scarf表达增强并出现在核内，说明其在屏障重建中的作用。这些结果提示Scarf作为Ca2+的感受器，在恢复表皮Ca2+梯度和重建表皮屏障中，以钙依赖的方式调节其靶蛋白的功能［3］。6  钙感觉受体(calcium sensing receptor，CaSR)    首先在人角质细胞鉴定出钙感觉受体，被看作是角质细胞终末分化过程中介导钙信号的候选分子。它属于G蛋白耦联膜受体超家族的成员之一，可将钙信号转入细胞，激活磷脂酶C，产生肌醇三磷酸(IP3)，引起胞内钙(［Ca2+］i)释放。角质细胞还表达一种缺失外显子5的剪切变体，它不能介导对胞外钙离子(［Ca2+］o)的急性反应。CaSR全长转录本主要在未分化角质细胞中表达，细胞分化时其表达降低。而剪切变体转录本的表达贯穿整个分化过程。分化过程中细胞对［Ca2+］o的反应性降低，导致［Ca2+］i和IP3水平下降的现象与这些分子的变化一致。小鼠表皮也存在CaSR，应用CaSR基因缺失小鼠对其功能进行研究，发现小鼠表皮同样表达CaSR和它的变体蛋白。全长CaSR基因缺失时，CaSR剪切变体蛋白表达增加。突变小鼠的角质细胞对胞外钙没有反应，提示全长CaSR是角质细胞介导钙信号必需的。全长CaSR缺失可使表皮的形态特征改变，角质细胞分化标志物之一loricrin mRNA和蛋白水平表达均降低。CaSR对表皮分化具有重要作用，它的作用是剪切变体CaSR无法替代的［11］。    综上所述，钙和钙梯度在哺乳动物皮肤稳态平衡中具有重要作用。同时调控钙和钙梯度有利于皮肤损伤修复。钙能启动细胞增殖、调控细胞迁移和分化模式。微小的钙浓度的变化也会对细胞产生影响，最终进入终末分化。钙在皮肤中的作用主要通过钙结合蛋白来实现。因此，利用新技术、新方法定位、分离和研究关键的钙结合蛋白(CaBPs)的功能，也正是今后研究钙信号系统在皮肤损伤修复中作用的关键。【参考文献】  1 Elaine F.Skin stem cells:rising to 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