BAI-1在肾细胞癌组织中的表达定位及与VEGF MCD P53蛋白相关性研究

肾细胞癌(renalcellcarcinoma,RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其发病率在泌尿系肿瘤中仅次于膀胧癌，位居第二位。2001年美国统计RCC的发病率比1950年上升12.6%，病死率上升36.5%，对于免疫、化学、放射治疗均不理想，目前手术治疗仍是其主要治疗手段，中晚期肾细胞癌手术后复发率、远处转移率很高。众所周知，肾细胞癌的特点是肿瘤内血管丰富，肿瘤生长、转移都依赖于血管的生长。近年来针对这一特点，抑制肿瘤血管生长的靶向治疗被越来越多的人关注。　　1997年Nishimori等利用人脑胶质瘤研究具有功能的P53结合位点的靶基因时，分离出一种新的靶基因，其特异性表达于人的脑组织中，具有抑制血管生成的作用。因此命名为脑特异性新生血管抑制因子1(Brain-SpecificAngiogenesisInhibitor1，BAI-1)。后续的研究发现BAI-1不仅仅在月齿组织中存在，结肠、胃、肺、胰腺等组织中也发现了BAI-1的存在。BAI-1属于G蛋白偶联受体的分泌素受体家族，Mori等通过细胞培养基因转染发现BAI-1蛋白定位于细胞浆及细胞膜上，主要集中于细胞膜。有研究通过亲水性分析发现BAI-1蛋白是一种多重跨膜蛋白，N末端包含30个氨基酸残基的分泌型信号序列，下游有两种功能元件:精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(RGD)，可以与整合素结合，而整合素可抑制由成纤维细胞生长因子诱导的血管生成.5个血小板凝血酶敏感蛋白1（thrombospondin-1,TSP-I)重复序列，TSP1为多肤类内源性新生血管抑制剂，主要通过TSRs与内皮细胞CD36分子的相互作用来抑制由成纤维细胞生长因子(FGF)诱导的新生血管生成。因此BAI-1可能具有抗肾细胞癌血管内皮细胞增殖的作用，可成为新的抗肿瘤血管生成因子。　　1材料与方法　　1.1病例资料　　收集天津医科大学第二医院泌尿外科2007年1月至2011年12月肾细胞癌根治术标本133例，其中对照肾组织133例为癌旁4cm以外肾组织(病理学证实)新鲜肾细胞癌标本27例，癌旁4cm以外肾组织15例。患者年龄46-82岁，平均年龄56(56.13±13.98)岁。所有患者均为初治，术前均未进行化疗、放疗及其他保守治疗所有肾细胞癌病例均已经过病理证实为透明细胞癌。　　1.2方法　　1.2.1免疫组化　　标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4um厚连续切片3张，采用SP法染色，一抗为兔抗人BAI-1多克隆抗体，鼠抗人P53单克隆抗体(Abcam公司)，兔抗人CD多克隆抗体、兔抗人VEGF多克隆抗体(武汉博士德公司)。抗体稀释比均为1:100a以正常肾组织为对照组，按TNM(AJCC,2002)分期进行分组，分为2组:局限期肾细胞T,组101例，进展期肾细胞癌T组犯例。　　1.2.2Westernblot　　收集临床肾细胞癌根治术后标本27例按TNM分期分为2组:局限期T组23例，进哭期T组4例二癌旁>4cm处肾组织15例二分别检川组织中BAI-1的蛋白含量二用液氮冰冻组织样本提取蛋白并测定浓度。取蛋白20ug行Tris-甘氨酸SDD聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE),6%的分离胶和5%的浓缩胶。电泳完成后，电转移法将蛋白转移到PVDF膜。5%脱脂奶粉的TTBS封存PVDF膜。加一抗BAI-1兔抗人多克隆抗体(SantaCruz,1500),40C过夜。加HRP标记的二抗，室温孵育2h0杂交膜用ECL化学发光试剂于暗室中显影并感光胶片GAPDH作为内参。　　1.2.3结果判定标准BAI-1,VEGF,P53,MVD免疫组化结果判定方法参考牟成金等”研究，综合细胞染色强度及阳性细胞占总细胞数的百分比，进行半定量分析。染色强度评分标准:不着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分;阳性细胞比例评分标准:<5%为0分，6%~25%为1分，26%~50%为2分，51%~75%为3分，)76%为4分。每张切片读取10个视野的平均值，将细胞染色强度计分和阳性细胞比例计分相加，作为最后积分。根据最后积分，0}1分为(一),>1分且(3分为弱阳性(+),>3分且〔5分为阳性(++),>5分为强阳性(+++)。以(+~+++)为阳性。　　1.3统计学分析　　用SPSS17.0软件分析二使用X检验、Spearman相关分析法分析临床病理参数与免疫组化结果之间的相关性。假设检验的检验水准取a=0.05。以P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1BAI-1在正常肾组织及肾细胞癌中的表达　　正常肾脏中BAI-1含量明显高于肾细胞癌组织(P<0.01，表1)aROC曲线下面积(Area)=0.890，标准误(Std.Error)=0.020,P=0.000，95%CI:0.851~0.930,表明BAL-1的免疫组化结果对于肾细胞癌与正常组织的区分具有一定的诊断价值。Westernblot检测结果与免疫组化结果完全一致，‘肾细胞癌组织中BAI-1蛋白的含量明显低于对应的正常肾组织，并且与肿瘤的TNM分期相关2.2BAI-1在不同临床分期及病理分级肾细胞癌中的表达差异早期肾细胞癌中BAI-1含量明显高于晚期肾细胞癌(P<0.05)。ROC曲线下面积(Area)_0.741，标准误(Std.Error)=0.051,P=0.000,95%CI:0.641一0.842，表明BAI-1的免疫组化结果对于肾细胞癌T与T的区分具有一定的诊断价值。　　2.3BAI-1表达与VEGF,MVD,P53的关系　　通过统计学分析得出，133例肾细胞癌组织中BAI-1表达与P53正相关，与VEGF,MVD负相关。　　3讨论　　当肿瘤直径超过1一2mm时，肿瘤生长所需的氧气和养分供应，主要依赖于新生血管的生长。目前研究发现众多血管生成因子调控着肿瘤血管的新生，正调节因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子((TGF)、血管生长素(angionenin)等，负调节因子包括血小板反应蛋白(TBS)、血管抑素(angiostatin)、内皮抑素(end-ostatin)等，这些因子作为肿瘤血管基因治疗的靶分子受到人们的关注，有的已进人临床实验阶段。　　BAI-1基因含有5个血小板凝血酶敏感蛋白1(TSP-I)重复序列，在体外可抑制由基底膜成纤维细胞生长因子(bFGF)诱发的血管新生，该基因至少有一个功能性的P53结合序列诱导P53活化，发挥抑癌基因的作用。　　BAI-1在人脑、结肠、胃、肺以及胰腺等正常组织中均有表达，而在对应恶性肿瘤中，BAI-1含量会明显减少甚至不表达。本实验发现，BAI-1在人正常肾组织中高表达，而在肾细胞癌组织中表达会减少甚至缺如，并且其表达减少程度与肾细胞癌恶性程度具有一定相关性二肾细胞癌恶性程度越高，BAI-1表达越少，在T期肾细胞癌中甚至可以看到BAI-1完全不表达。这一结果证实了之前的猜想，BAI-1可能是一种潜在的抑癌蛋白，通过其抗肿瘤血管增生来抑制恶隆钟瘤的发生发展，这可能与BAI-1的TSR重复区有关.该区域具有抑制肿瘤血管的生成功能，去除BAI-1就相当于去除了肿瘤细胞内血管生成的阀门从而使钟瘤内血管生长加速。所以BAI-1的重新表达或者BAI-1的膜外片段成为治疗肿瘤的新的一个靶标蛋白。　　血管内皮生长因子(VEGF)是一种分泌型糖蛋自，能够特异性促血管内皮细胞有丝分裂。其表达是大多数恶性肿瘤细胞无限增殖的必要条件。VEGF的高表达与肿瘤患者的生存时间、早期复发、浸润及转移等有关。MVD是衡量微血管形成的定量指标，是将肿瘤中的微血管通过特异性抗原如珊因子相关抗原、CD34,CD31或CD105染色以显示血管内皮细胞，然后在显微镜下计数微血管数量的一种方法，MVD可作为判断泌尿系肿瘤恶性程度、复发、转移、预后的重要指标目前认为CD34是最敏感的内皮细胞标记物，而且CD34标记的MVD对预后的判断价值也最大。　　本实验通过对正常肾组织及不同分级肾细胞癌组织的对比研究分析发现，BAI-1含量与VEGF,MVD是成反比的同时根据对BAI-1结构的研究可以发现，BAI-1为跨膜蛋白，其胞膜外有2个功能区域，其中一个为血小板凝血酶敏感蛋白1(TSP1)重复区。TSP1可以抑制由成纤维细胞生长因子(FGF)诱导的新生血管生成，而VEGF可以受FGF调控。本实验结果也符合这一结果，BAI-1表达与VEGF,MVD呈负相关，从而证实了BAI-1在抑制肿瘤血管生长方面的作用。　　BAI-1是在研究P53时被分离出来的，并且发现其受野生型P53表达调控，而在变异P53组织中无表达，具体调控机制目前仍不清楚。本实验中免疫组化结果显示在肾细胞癌组织中P53含量明显减少，同时其减少程度与肾细胞癌恶性度成正相关。而这种相关关系与BAI-1在不同恶性度肾细胞癌中的表达相符合，因此本实验猜测BAI-1在肾细胞癌中表达减少可能与P53突变有关，并且依据其突变程度决定其减少程度。　　BAI-1因其结构功能使其可能具有了抗肿瘤血管生长的作用，而且其作用机制、特性等至今仍不十分清楚，本实验通过对肾细胞癌组织进行免疫组化检测初步验证了BAI-I对VEGF,MVD之间关系，但尚需要进一步研究。对BAI-1抑制肿瘤新生血管生成全面了解，将为恶性肿瘤浸润转移的探索和治疗开辟新的道路。　　参考文献　　1.Rodríguez-Antona C,García-Donas J. 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