STAT3与miRNA-21在舌鳞状细胞癌中异常表达的相关性研究

舌鳞状细胞癌(以下简称为舌鳞癌)是领面头颈癌中最常见的恶性肿瘤之一’近年，尽管化学治疗、放射治疗和靶向治疗等均有了长足的发展，但是晚期舌鳞癌的预后却难以令人满意2晚期舌鳞癌仍是肿瘤学领域的难治性疾病，阐明舌鳞癌发生机理.寻找新的治疗靶点日益受到重视。　　信号转导与转录活化因子3(signaltransducersandactivatorsoftranscription3,STAT3)是信号传导与转录活化因子家族的重要成员之一，是与肿瘤细胞增殖、凋亡、化疗耐药等生物学行为密切相关的转录因子。miRNA(microRNA或miRNA)为长度约21-25帅的非编码RNA，这些miRNA能够识别特定的目标mRNA，并在转录后水平通过促进靶mRNA的降解和/或抑制翻译过程而发挥负调控基因表达的作用。近年研究发现，miRNA-21过表达是多种上皮系统来源恶性肿瘤的分子标志。我们前期研究提示，干预miRNA-21表达能有效抑制舌鳞癌细胞体外增殖并诱导凋亡。　　迄今，尚无对舌鳞癌中STAT3与miRNA-21的表达进行深人研究。为此，本文将初步探究舌鳞癌中STAT3与miRNA-21表达的相关陛以及与预后的关系。　　1材料与方法材料　　1.1材料　　1.1.1病例与组织标本来源收集天津医科大学附属肿瘤医院1995年1月至2004年12月间外科手术切除舌鳞癌标本124例。纳入标准:1)组织病理诊断明确;2)TNM分期明确;3)临床资料完整;4)临床随访)5年。总生存期定义为从疾病确诊时间至患者失去随访或死亡时间。其中高分化鳞癌63例、中分化鳞癌48例，低分化鳞癌13例。所有组织标本去除出血、坏死及电灼组织，用生理盐水洗去血污并经福尔马林固定后制作石蜡切片。　　1.1.2舌鳞癌细胞系来源及培养条件舌鳞癌细胞系CAL-27购自中国医学科学院基础医学细胞中心;TSCCA,Tca8113,Tca8113-P160细胞系均购自武汉大学中国典型培养物保藏中心;Tb3.1细胞由上海交通大学附属第九人民医院提供。含10%热灭活FBS(Hyclone公司，美国)，4mM谷氨酚胺，50U/mL青霉素和50}A,g/mL链霉素的DMEM(购自Gibc。公司，美国)或者RPMI-1640(购自Gibco公司，美国)培养基，培养基的总体积约为培养皿容积的1/5，培养条件为370C,5%CO-湿润培养。　　1.2方法　　1.2.1WesternBlot法检测STAT3表达随机挑选对数生长期TB3.1,CAL-27,TSCCA,Tca8113,Tca8113-P160细胞阳性克隆扩增充分后常规消化接种于细胞培养皿;经按上述常规方法培养细胞后，弃去培养基，使用100},L预冷RIPA裂解液充分裂解细胞，紫外分光光度计测定各细胞总蛋白浓度;各孔加入等量总蛋白进行垂直电泳，转膜，TBS漂洗，封闭液封闭1h,GAPDH作为内对照。加人多克隆STAT3和GAPDH抗体(1:100稀释，购自SAB公司，美国)40C孵育过夜，GAPDH作为内对照。辣根过氧化物酶标记的二抗(1:100稀释，购自中杉金桥公司，北京)室温孵育1一2h，滴加化学发光底物(购自Pierce公司，美国)，凝胶成像系统(购自Bio-Rad公司，美国)采集图像并扫描各条带计算灰度值。所检测指标的蛋白条带灰度值与GAPDH的比值作为蛋白的表达相对量。　　1.2.2免疫组织化学法检测组织标本STAT3表达与结果判读石蜡切片常规脱蜡至水;加人STAT3抗体40C孵育过夜;生物素标记二抗(1:100稀释，购自中杉金桥公司，北京)370C孵育2h;辣根酶标记链霉卵白素(1:100稀释，购自中杉金桥公司，北京)，370C孵育30min;DAB显色剂显色;常规脱水、封片。使用DP70CCD采集图像;IPP6.0软件(购自Olympus公司，日本)分析结果。以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，每张切片随机观察5个视野计算染色强度及阳性细胞率。结合染色强度和阳性细胞百分比两个参数综合评价STAT3阳性染色:首先行染色强度评分共0一3分:无染色评分0;弱染色评分1;中等强度染色评分2;强染色计评分3;再按照阳性百分数评分:阳性细胞数<10%评分0;(10}30)%评分1;(30一50)%评分2;(50一100)%评分3。评分标准(两计分相加，总分0一6分):0一1分为(一),2一3分为(+),4一5分为(++),6分为(+++)。　　1.2.3荧光实时定量PCR法检测组织标本miR-NA-21表达Trizol一步法(Ambion公司，美国)提取细胞总miRNA,紫外分光光度计测定各细胞RNA浓度，采用SYBRGreen-I荧光染料掺人法，以U6为内参扩增miRNA-210miRNA-21上游引物序列:5'-TTTCTTGCCGTTCTGTAAGTG-3'，下游序列:5'-TGGATATGGATGGTCAGATGAA-3';U6对应的探针序列为5'-ATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3'(miRNA-21及U6引物购自吉玛公司，上海)。PCR反应条件为950C3min,950C12s,620C40s，共进行40个循环;于75--95℃范围内绘制溶解曲线。Opticon3软件计算△C(t)值。　　1.2.4荧光原位杂交法检测组织标本miRNA-21表达石蜡切片常规脱蜡至水，经4%多聚甲醛室温固定，胃蛋白酶消化，预杂交液400C孵育3h，加人miRNA-21杂交探针液((0.5ug/uL，购自博士德公司，武汉)400C孵育过夜，SSC缓冲液梯度充分洗涤切片，鼠抗地高辛380C孵育1}2h。卵白素标记的Cy3(1:100稀释，购自博士德公司，武汉)37℃孵育1h,DAPI染料(购自Sigma公司，美国)染核8min，水溶性封片剂封片，采用DP-70荧光相差倒置显微镜采集图像。以细胞质内红色荧光为阳性细胞，评分标准同1.2.2中所述，并通过应用Cluster,Treeviev、一软件对荧光活性评分绘制组织热图。　　1.3统计学方法　　使用SPSS16.0统计软件包进行数据处理RxC列联表丫检验检测STAT3,miRNA-21在不同分化程度组织中的表达情况，STAT3及miRNA-21表达的相关性及与生存期的关系用Spearman等级相关分析;STAT3,miRNA-21与生存率之间的关系采用Ka-plan-Meier法。P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1STAT3在舌鳞癌细胞系中的表达　　本课题组前期实验证明Tb3.1舌癌细胞中STAT3过表达，将Tb3.1细胞中STAT3蛋白的相对表达量设定为参考值1。四种舌鳞癌细胞系中STAT3相对表达量为:CAL-27(1.33士0.35),TSCCA(1.50士1.13),Tca8113(1.03士0.25),Tca8113-P160(1.06士0.25)四种舌鳞癌细胞STAT3表达与Tb3.1细胞相比，差异无统计学意义(P>0.5)，因此，本文认为在上述四种舌癌细胞中均存在STAT3表达升高现象。　　2.2STAT3在舌鳞癌组织标本中过表达　　免疫组织化学染色显示:不同分化程度的舌鳞状细胞癌中均存在STAT3过表达，高分化鳞癌中STAT3阳性率为(10.5319.76)%;中分化鳞癌STAT3阳性率为(46.78士18.25)%;低分化鳞癌STAT3阳性率为(87.46士13.17)%，即鳞癌分化程度越差，STAT3阳性率越高STAT3表达与舌鳞癌标本分化程度相关(r=0.837,P<0.001)。　　2.3miRNA-21在舌鳞癌细胞系中过表达　　Tb3.1人舌癌细胞系中miRNA-21存在过表达，因此将该细胞miRNA-21相对表达量设定为参照值1，将其余舌鳞癌细胞中miRNA-21相对表达量与之做比值，分别为:CAL-27(1.2710.30),TSCCA(2.13士0.20)、Tca8113(5.97士0.31)、Tca8113-P160(4.43士0.61)oTca8113细胞系miRNA-21表达较其他舌鳞癌细胞系高，四种舌鳞癌细胞中均存在miRNA-21过表达现象。　　2.4miRNA-21在舌鳞癌组织标本中过表达　　不同分化程度舌鳞癌标本中存在不同程度miR-NA-21表达且阳性信号均匀分布。高分化鳞癌中miRNA-21阳性率为(27.61土8.56)%;中分化鳞癌miRNA-21阳性率为(56.80士16.93)%;低分化鳞癌miRNA-21阳性率为(77.63士15.31)%。分析发现miRNA-21的表达水平和口腔鳞癌分化程度存在相关性(r=0.879,P<0.001)，即口腔鳞癌标本病理分化程度越低、miRNA-21表达越强。　　2.5舌鳞癌中STAT3与miRNA-21表达正相关本文采用Spearman等级相关依次分析了所收集的124例舌鳞癌标本中STAT3与miRNA-21表达相关性，相关系数为0.574(P<0.001)。　　2.4舌鳞癌中STAT3,miRNA-21表达与患者生存期的相关性分析　　本文所收集124例舌鳞癌患者男女比例(1.86:1),年龄3572岁，中位年龄54岁。将舌鳞癌中STAT3免疫组化评分与miRNA-21荧光活性评分中>3分者定义为高表达，<3分为低表达。Kaplan-Meier法对STAT3、miRNA-21不同表达组患者的生存期进行分析。相关险分析显示STAT3(r=0.554,P<0.0001),miRNA-21(r=-0.606,P<0.0001)表达均与患者的生存期呈负相关。　　3讨论　　miRNA-21在胶质瘤、肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中表达升高，并能通过抑制PTEN,PDCD4,TIMP3,TMP-1,RECK,p53等抑癌基因的翻译过程参与调控多种恶性肿瘤的发生。Kimura等3miRNA表达谱研究结果提示miRNA-21在头颈部鳞状细胞癌和食管鳞状细胞癌细胞系中均为过表达Song等6miRNA表达谱研究结果同样表明在103例舌鳞状细胞癌标本中miRNA-21为过表达，反义miRNA-21能够抑制SCC-15和CAL27细胞的生长本研究前期提示，转染反义miRNA-21寡核背酸后，

    3.1人舌癌细胞增殖与侵袭能力被抑制。上述结果都提示miRNA-21过表达可能是影响口腔鳞癌发生的分子事件之一，并可能成为口腔鳞癌基因治疗的候选靶点。本研究就miRNA-21表达状况和舌鳞癌分化程度相关性的初步探讨提示，低分化鳞癌组织中miR-NA-21表达要高于中、高分化鳞癌患者;且低分化鳞癌患者的总生存率低于高、中分化鳞癌患者最近一项关于miRNA-21表达与不同肿瘤患者预后的临床荟萃分析示，miRNA-21高表达肿瘤患者总生存率低于miRNA-21低表达者，危险比是1.69(95%CI:1.33一2.16);其中头颈部鳞癌患者miRNA-21高表达者总生存率也低于低表达者，危险比是1.48(95%CI:1.08)2.26。近来，研究人员开始关注循环miR-NA-21，认为血清中升高的miRNA-21表达对恶性肿瘤的早期诊断、肿瘤转移、肿瘤进展、对治疗的反应和预后等方面具有预测价值。通过文献分析综合本次研究结果，推定miRNA-21可能通过某种机制参与调控口腔鳞癌的分化过程。miRNA-21过表达和口腔鳞癌患者生存率呈负相关，可做为口腔鳞癌预后预测因子之一。　　STAT3在多种恶性肿瘤如乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、白血病等均有过度表达，其表达水平与肿瘤的生长、分化、转移及预后等密切相关受体酪氨酸激酶如EGFR和非受体酪氨酸激酶(Jak,Sro,Ahl等)可使STAT3梭基端转录活化区的酪氨酸磷酸化而激活STAT3，活化的STAT3与酪氨酸磷酸化位点的相互作用形成二聚体转人细胞核，参与调节肿瘤细胞增殖、凋亡、转移等相关的靶基因的转录。在头颈鳞癌患者中，肿瘤组织和正常上皮中STAT3的表达水平均高于非癌患者正常上皮，这与本实验中STAT3在舌鳞癌组织中免疫组化染色结果相符二提示STAT3信号通路的持续激活在人舌鳞状细胞癌的进展和侵袭中发挥重要作用同时，STAT3表达水平与舌鳞癌患者生存期相关性的研究表明，STAT3有望成为判断舌鳞癌预后和治疗效果的指标。　　近年来miRNAs与STAT家族成员的相互关系，尤其miR-21和STAT3信号通路的相互作用得到初步阐述二Grandis等的研究中利用生物信息学方法预测了miNA-21编码基因启动子区域有STAT3的结合位点早期的研究证实，编码miRNA-21基因的调节区位于跨膜49基因的内含子中，并为上游增强子所调控，而该增强子调控序列含有两个Stat3的结合位点，推测IL-6/Stat3抗凋亡信号通道是miRNA-21潜在的调控机制。骨髓瘤细胞中，miR-21的转录可受到其上游包含2个ST_-1T3结合位点的增强子的直接调控。抑制STAT3的表达后发现可阻碍由IL-6介导的miRNA-21的表达，然而尚无研究证实在口腔癌中的miRNA-21和STAT3存在正性i周控关系，实验表明舌癌组织和细胞中miRNA-21与STAT3间存在正相关性，且对预测患者预后具有一定的价值，而具体的调控机制有待进一步研究。　　目前人们已经发现针对STAT3和非编码RNA的小分子抑制剂，能够有效抑制STAT3通路活性和miRNA的表达，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，诱导癌细胞凋亡本文研究显示舌鳞癌miRNA-21及STAT3的表达状态与患者生存期的相关性。miRNA-21与STAT3可做为口腔鳞癌基因治疗的候选靶点。　　参考文献　　1.Parkin DM,Pisani P,Ferlay J. Global cancer statistics[J].CA Can-cer J Clin,1999,(I):33-64.　　2.Schmidt G,Molik M,Barthel P. Heart rate turbulence after ventricular premature beats as a predictor of mortality after acute myocardial infarction[J].{H}LANCET,1999,(07):1390-1396.　　3.Kimura S,Naganuma S,Susuki D. Expression of microRNAs in squamous cel carcinoma of human head and neck and the esoph-agus：miR-205 and miR-21 are specific markers for HNSCC and ESCC[J].{H}Oncology Reports,2010,(06):1625-1633.　　4.Bromberg JF,Wrzeszczynska MH,Devgan G. Stat3 as an on-cogene[J].Cel,1999,(03):295-303.　　5.周旋,任玉,许鹏. 反义miR-21抑制U251人脑胶质瘤细胞株增殖的体外研究[J].{H}中华神经外科杂志,2009,(08):746-749.　　6.Song JI,Grandis JR. STAT signaling in head and neck cancer[J].{H}ONCOGENE,2000,(21):2489-2495.　　7.陶英杰,任玉,董家斌. 反义微小RNA-21寡核苷酸抑制Tb3.1人舌鳞状细胞癌增殖的体外研究[J].{H}中华口腔医学杂志,2011,(02):8279-8320.　　8.Kim DJ,Chan KS,Sano S. Signal transducer and activator of transcription 3(Stat3) in epithelial carcinogenesis[J].{H}Molecular Carcinogenisis,2007,(08):725-731.　　9.Rubin Grandis J,Zeng Q,Drenning SD. Epidermal growth factor receptor-mediated stat3 signaling blocks apoptosis in head and neck cancer[J].{H}LARYNGOSCOPE,2000,(5 Pt 1):868-874.　　10.Grandis JR,Drenning SD,Chakraborty A. Requirement of Stat3 but not Stat1 activation for epidermal growth factor receptor- medi-ated cel growth In vitro[J].{H}Journal of Clinical Investigation,1998,(07):1385-1392.　　11.L?ffler D,Brocke-Heidrich K,Pfeifer G. Interleukin-6 depen-dent survival of multiple myeloma cel s involves the Stat3-mediat-ed induction of microRNA-21 through a highly conserved enhanc-er[J].{H}Blood,2007,(04):1330-1333.　　12.Shen XH,Han YJ,Zhang DX. A link between the interleu-kin-6/Stat3 anti-apoptotic pathway and microRNA-21 in preim-plantation mouse embryos[J].Mol Reprod,2009,(09):854-862.