幽门螺旋杆菌感染与胃癌侵袭转移及血浆核黄素水平的关系
发表时间：2015-01-30 浏览次数：1011次
食管癌的病因复杂,但免疫抑制是一重要因素.NK细胞具有直接杀伤肿瘤细胞的功能,但食管癌患者NK细胞功能明显降低’、近年来研究发现,NK细胞活化性受体自然杀伤细胞2族成员D(natu-ralkillergroup2,memberD,NKG2D)在介导NK细胞的抗肿瘤免疫中发挥重要作用.其配体MHC-I类链相关蛋白A(MHCclassIchain-relatedproteinA,MICA)与NKG2D特异性结合,通过转接蛋白(DAP10或DAP12)传递活化信号,动员含有穿孔素和颗粒酶B的颗粒与肿瘤细胞连接,导致肿瘤细胞溶解从而发挥抗肿瘤效应2然而许多恶性肿瘤(如肺癌,胃肠癌,肝癌,前腺癌,多发性骨髓瘤)通过释放可溶性MICA抑制NK细胞的功能3本课题通过检测食管癌细胞株及组织中MICA的表达,血清中可溶性}}TICA的含量及可溶性MICA对NK细胞NKG2D的影响,分析食管癌患者MICAI陆床意义. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1研究对象150例食管癌患者来自本院2009年10月至2012年OS月住院患者,均经病理确诊一其中鳞癌133例,腺癌17例,所有患者采集血清前均未进行任何治疗一10例健康成年者外周血来自志愿者食管癌细胞株Eca-109及TE-1购自上海细胞所. 1.1.2试剂鼠抗人CD3mAh-FITC,CD56mAlo-PE 和NKG2DmAb-APC购自美国BD公司;MICA-PE购自美国R8D公司;sMICA的ELISA检测试剂盒购自美国Abcam公司;培养液RPMI1640购自美国GIBCO公司. 1.2方法 1.2.1流式细胞术检测细胞表型\K细胞表面\KG2D的检测:单克隆抗体鼠抗人1\KG2D-APC,CD3-FITC,CD56-PE各5O,L种不同荧光抗体同时标记血细胞,混匀后避光室温孵育15min,1200r/min,离心s111111,弃上清,每管加人PBS溶液0.3mL,重悬后上机检测二利用CELLQUEST软件,选择CD3-CD56‘的细胞群设门,先用空白对照管设置仪器检测参数,再以每管不少于10000个细胞的条件收集细胞所有检测管行IgG同型阴性对照,用FAGSCalihu:流式细胞仪(美国BD公司)进行检测,经CEL-LQUEST软件分析食管癌细胞MICA的检测:人食管癌细胞株Ec}a-109及TE-1各取1x10"个细胞,加人5},LMI-C.-1-1'E抗体新鲜食管癌手术组织标本,癌旁取自癌周)5cm组织,机械分离单个核细胞,200目尼龙网过滤,I'BS洗涤去除脂肪等杂质,加人5},LMI-CA-I'E抗体标一记,IgG同型阴性对照,上机检测. 1.2.2血清可溶性MICA(sMICA)的测定取外周血3mL于无抗凝十管中,2h之内分离血清,-80℃冰箱保存.根据试剂盒的操作说明书,以双抗体夹心ELISA法险测血清中sMICA含量先不稀释血清样本,初步检测如果标本超过试剂盒的标准曲线范围(1000ug/L156.3ug/L),将标本根据需要进行稀释重新检测. 1.2.3;MICA对NK细胞NK2D的影响为了便于观察:MICA对NK细胞NK2D的影响,本研究取sMICA大于均值(约2000ug/L)定为sMICA阳性患者血清,:}IIC.}阴性患者血.清为低于EL1SA检测的下限值(即156.3ng/L),所加的血清最终浓度为5%按以下方案分为Group1:健康成人NK细胞十健康成年者血清;Group2:健康成年者NK细胞+sMICA阴性患者血清;Group3:健康成年者NK细胞++sMICA阳性患者血清.于培养24h收集,FCM检测NK细胞中NKG2D表达变化. 1.2.4NK细胞的分选为了检测NK细胞对食管癌细胞株的杀伤能力,选取5例健康供者进行NK细胞分选步骤简述如下:Ficoll法分离外周血单个核细胞,加人生物素标记混合抗体(NKcellbiotinantibodycocktail)孵育10min,离心洗涤,加入抗生物素磁珠抗体(NKcellmicrobeadcocktail)孵育15min,离心洗涤,使用德国Meltenyi公司Vario-MACS系统过柱,收集未标记的细胞即为NK细胞流式细胞术(FCM)检测分选前后CD3-CD56·细胞的纯度. 1.2.5LDH法检测NK细胞对食管癌细胞株Eca-109的杀伤为了检测健康NIA细胞与sMICA血清培养前后,刊细胞株Eca-109杀伤活性,按上述1.2.4方法.先进行健康外周血NK细胞进行分选,分选后NK细胞纯度达90}/}以土应用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒,NK细胞调密度至1x10`'/mL,食管癌细胞株Eca-109作为靶细胞,按20:1效靶比加人96孔U型板中,终体积200p,L/孔,设3个复孔根据说明书设立对照组,包括加人靶细胞的自发释放组(SR靶)、加人靶细胞井在检测前40min加人10mL/LTriton-100的最大释放组(MR靶),只加入效应细胞的自发释放组(SR效J}n),在370(:}I}=箱中培养4h二250gx10min离心后,吸出50},L/孔卜清,转移至另一ELISA板,加人50},L/孔LDH反应液,室温避光放置30min后,测定492nm的吸光度(A)值,杀伤活性=[(实验孔一SR效)}l-SR靶)/(MR靶-SR靶)]x100%1.3统计学方法SPSS12.0统计分析软件分析实验数据7十量资料采用以几、表示,两个样本均数的比较应用独立样本t检验,多组样本均数的比较应用方差分析同时进行多重均数比较SiVK-q检验,相关分析用秩相关(Speanman)P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1食管癌组织及细胞株MICA的表达 流式细胞术检测食管癌新鲜组织及细胞株MI-CA的表达(图1)-MICA在食管癌旁组织(图1A)中无表达,食管癌组织中31.7%}38/120)表达(图1B),表达量为(42.2士7.6)%,与癌旁组织MICA泊勺表达有显著性差异(P<0.01),2种食管癌细胞株,Eca-109表达量为(69.23士2.12)%(图1C),TE-1表达量为(78.8213.06)%(图1D). 2.2可溶性MICA的含量 尽管肿瘤患者的癌细胞表面均有表达MICA,但不能诱导完全有效的免疫应答反应,表明机体存在一些影响NKG2D发挥作用的机制_可溶性MICA(sMICA)的存在和产生可能是一主要的原因本研究应用ELISA方法检测食管癌患者外周血sMICA表1),健康成年者未检测到、MICA,在食管癌患者中sMICA含量达(1977.30士292.67)ng/L,74.670l0(56/75)患者阳性表达临床因素的相关分析表明,aMI-CA含量与TNM分期呈正相关(r=0.757).即越晚期患者血清中sMICA含量越高而且在有远处转移组比无远处转移组高,差异具有统计学意义(P<0.05). 2.3食管癌患者血浆中sMICA与NK细胞NKG2D的关系根据流式细胞术检测结果,健康成年者外周血NK细胞NKG2D表达为(96.7士2.1)%,乳腺癌患者为但sMICA含量与病理类型无显著性差异(P>0.05)(82.2+10.5)%,差异有统计学意义(P<0.01).进一步分析食管癌患者NK细胞NKG2D的表达与对应血清中sMICA关系(图2),NKG2D的表达与sMICA水平呈负相关(r.=-0.610),即食管癌患者sMICA含量越高,外周血中NK细胞NKG2D的表达越低. 2.4sMICA对NK细胞NKG2D及杀伤活性的影响 为了证实sMICA对NK细胞活化性受体NKG2D的影响,本研究在健康人NK细胞培养过程中加入含sMICA阳性的血清,于培养24h收集,流式细胞术检测NK细胞受体NKG2D表达变化的结果(图3A),Group3}sMICA阳性患者血清+健康者NK细胞)中加人sMICA阳性血清后,24h后NK细胞表面受体NKG2D表达明显下调,与其他2组对比差异具有统计学意义(P<0.05)其他2组与培养前比较差异无统计学意义(P>0.05)asMICA下调NK细胞活化性受体NKG2D表达,结果显示,Group3(sMICA阳性患者血清+健康者NK细胞)中加人sMICA阳性血清后,24h后NK细胞对食管癌细胞株ECA-109的杀伤明显降低,与其他2组比较差异具有统计学(P<0.01)其他2组与培养前比较差异无统计学意义(P>0.05,图3B). 3讨论 NK是机体内主要的抗肿瘤免疫效应细胞,其功能状态与细胞表面的C型凝集素样活化型受体NKG2D密切相关.NKG2D识别的配体在人类主要有3个,分别为MICA,MICB及ULBP(UL16-bindingprotein),但现有研究表明,在抗肿瘤免疫中起主要作用的是MICA肿瘤细胞MICA与NK细胞NKG2D结合后,能诱导死亡伴随蛋白一10的YxxM基序磷酸化,继而激活磷脂酞肌醇-3一激酶的P85亚基,使下游的蛋自激酶B磷酸化,从而激活细胞外信号调节激酶1/2和促丝裂原激活蛋白激酶旁路,并促使Ca-十内流,传递活化信号LZ本文前期研究6也发现乳腺癌细胞的膜型MICA可上调NK细胞的NKG2D水平,NKG2D受体通过"自我诱导"的免疫监视模式,使得NK细胞识别靶细胞表面的NKG2D配体.由此看出NKG2D-MICA途径在NK细胞杀伤中起到重要作用正常情况下MICA组织分布局限,但近年来发现MICA在许多肿瘤细胞均有表达或上调,因而被视为一种肿瘤相关性抗原’Busche等Y报道人肺癌组织有30%有MICA的表达,而Wu等一9报道前列腺癌中95%有表达,说明各种癌MICA表达不一样.本研究检测结果MICA在食管癌旁组织中不表达,食管癌中31.7%有表达,表达量为(42.2士3.6)%aMICA在机体内存在2种功能形式,即细胞表面的膜结合型MICA(memberMICA,mMICA)和游离状态的可溶性MICA(solubleMICA,sMICA),后者在免疫效应中的作用恰好相反,通过诱导NKG2D的内化和降解,促进肿瘤逃逸免疫应答.mMICA可通过多种机制脱落而成为sMICA.近年的研究多集中在金属基质蛋白酶和解聚素对MICA脱落的影响. Holdenriede:等’2〕发现恶性肿瘤sMICA高低与疾病发展阶段呈正相关,与肿瘤转移程度也密切相关. Rebmann等‘’采用ELISA法测定多发性骨髓瘤患者血清中sMICA后发现,sMICA可以作为衡量患者的完全生存率及无进展期生存率的独立预后因素.本研究中健康成人未检测到sMICA存在,在食管癌患者中sMICA含量达(1977.30士292.67)ng/L,阳性率为74.67}/_而且sMICA含量与TNM分期呈正相关,有远处转移比无远处转移高,但与病理类型无关. 本研究还发现,食管癌患者外周血中NKG2D的表达与血清sMICA呈负相关,即血清中sMICA含量越高外周血中NK细胞表面活化性受体NKG2D越低为了证实sMICA对NK细胞NKG2D的影响,流式细胞术检测食管癌患者NK细胞NKG2D表达明显低于健康成年人.本研究在食管癌患者淋巴细胞培养过程中加人含sMICA阳性的血清24h后,健康者NK细胞表面受体NKG2D表达明显下调,而且培养后NK细胞对食管癌细胞株ECA-109的杀伤活性明显降低上述结果提示血清中的sMICA通过下调NKG2D表达来抑制NK细胞的杀伤活性.Jinushi等‘"l发现肝细胞癌患者血清sMICA不仅通过下调NKG2D抑制NK细胞功能,同时因NK细胞功能受损导致树突状细胞(DC)对异己抗原反应的降低,从而导致了肿瘤的发生.因此NKG2D下调对肿瘤的发生有直接或间接的作用. MICA分子是把双韧剑,食管癌细胞上膜结合型MICA与NK细胞上受体NKG2D特异性结合,通过转接蛋白传递活化信号,导致肿瘤细胞溶解,起免疫监视作用,通过药物提高mMICA的表达,激活免疫系统杀伤肿瘤细胞.然而又通过释放可溶性MICA抑制NK细胞的功能,起免疫逃逸作用,可溶性MICA可作为对肿瘤分期及转移的标志.因此食管癌MICA的表达为肿瘤免疫、临床诊断、治疗与预后等各方面研究开辟了广阔前景. 参考文献 1.Yaghoobi M,Bijarchi R,Narod SA. Family history and the risk of gastric cancer[J].{H}British Journal of Cancer,2010,(02):237-242. 2.Li W,Zeng J,Li Q. 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