芹菜素诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞系非P53依赖性凋亡的研究

芹菜素是一种黄酮类化合物,广泛存在于蔬菜,水果及茶叶中’据报道,芹菜素能够对前列腺癌,胰腺癌等多种肿瘤细胞系产生增殖抑制作用}.i此外,芹菜素还具有诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期,抑制肿瘤的侵袭和转移等多种抗肿瘤活性.因其具有毒性小、致突变作用低等优势引起广泛关注4MDA-MB-231是突变型P53高表达细胞株,突变型P53不仅降低抑癌基因p53的生理调节功能,还可促进细胞发生恶性转化,并抑制其发生凋亡5P73是P53蛋自家族中重要成员万有研究表明,在p53突变或缺失的肿瘤细胞中,p73可代替p53靶向调节下游基因表达‘、其中,p53诱导基因3(PiG3)就是其下游调控细胞凋亡的重要靶基因之一本实验以MDA-MB-231细胞为对象,研究芹菜素对乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡诱导作用,并初步探讨非P53依赖性凋亡发生的分子机制.    1材料与方法    1.1材料    人乳腺癌MDA-MB-231细胞系由天津医科大学附属肿瘤医院中心实验室提供芹菜素购于美国Sigma公司RPMI1640培养基,胰蛋自酶及胎牛血清购于美国Hyclone公司一染料Hochest33342,Mito-trackerRed,Yo-Pro-1以及转染试剂盒Lipofectami-ne'、"2000购于美国Invitrogen公司AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒购于美国BD公司P53,P73,Ba},Bcl-2,Caspase-3,PARP,(3-actin一抗购J-美国CellSignalingTechnology公司PIG3一抗购于美国Milli-pore公司万HRP标记的坛G二抗购于中国Abmart公司双链小分子RNA购于美国Selleck公司.    1.2方法    1.2.1细胞培养MDA-MB-231细胞系常规培养于RPMI1640培养液中,内含10%胎牛血清,1%青霉素(100U/mL)和链霉素(100}A,g/mL),于含5%CO=的37℃恒温培养箱中培养,采用对数生长期的细胞进行实验.    1.2.2MTT法常规培养MDA-MB-231细胞,选取对数生长期的细胞以3x10'/}L接种于96孔板_细胞贴壁后将芹菜素分别稀释为.、10,20,40μM,按200},Li}L加入96孔板,对照组加人等量培养液,每组设3个复孔,分别培养24和48h以20},L/}L加人MTT(5g/L),41,后1000r/min离心5min,弃上清_再加人DMSO200},L/孔,370C震荡15min,直至紫褐色沉淀完全溶解采用酶标仪测定各孔在570nm波长处各孔吸光度值(A值),并计算肿瘤生长抑制率生长抑制率(%)=}1-(加药孔A值/对照孔A值)lx100%.    1.2.3荧光染色观察细胞形态学变化取对数生长期MDA-MB-231细胞,以2x105/mL接种于6孔板内加人.,10,20,40p,M不同浓度芹菜素处理24h后,再分别加人终浓度为5p.,g/mLHoechst33342,250nMMitotrackerRed和1N,MYo-pro-1,室温孵育30min后,于倒置荧光显微镜下观察.其中Hoch-est33342使细胞核呈蓝色荧光,MitotrackerRed使线粒体呈红色荧光,Yo-pr.一I则标记凋亡细胞呈绿色荧光.    1.2.4流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率不同浓度芹菜素0,10,20,40p,M分别处理细胞24h,收集细胞并调整细胞数至1x10}/mL,用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次.弃上清,加入100p,L染料结合缓冲液重悬后,分别加入10p.,LAnnexinV-FITC和5p,LP1染液(50mg/L),混匀后室温避光孵育15min,补加400p,L结合缓冲液,静置5min后检测凋亡率.    1.2.5Westernblot法检测凋亡及周期相关蛋白的表达收集.,10,20,40p,M芹菜素处理24h后各组细胞预冷PBS洗涤2次,加人裂解液充分裂解,提取总蛋自,BS:1法测定蛋白浓度,每孔加人相同蛋白质量的样品,在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中电泳分离蛋白,电转移至PVDF膜上,5%牛奶室温封闭1h,放人一抗(P53,P73,PIG3,Bax,Bcl-2,Caspase-3,PARP及(3-actin)中40C孵育过夜,次日用TBST洗涤3次,用HRP标记的羊抗兔二抗(1:10000)室温孵育Ih,TBST洗涤3次,ECL显影,于暗室曝光条带灰度值使用ImageJ软件进行分析.    1.2.6细胞转染选取对数生长期的乳腺癌MD A-MB-231细胞,转染前24h用0.125%的胰酶消化细胞,用不含抗生素和血清的RPMI1640制备单细胞悬液(1x10'/mL),将细胞悬液以2mL/孔重新接种于6孔板,使转染时细胞密度达到30%}50%.具体转染步骤参照Lipofectamine}'"2000转染试剂说明进行.    转染实验分别设立阴性对照组(转染scrambledsiR-NA)以及siRNA干扰组(转染p73-siRNA),转染浓度50nM.加人siRNA-Lipo2000混合物于培养液中,37℃恒温培养4一6h后,更换新鲜的生长培养基继续培养24h,随后各实验组分别给予40p,M芹菜素处理,空自对照组则不予以处理,24h后收集细胞.    1.3统计学分析    数据使用SPSS16.0软件进行分析,实验结果用均数士标准差(x1s)表示_组间差异比较使用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05表示差异有统计学意义所有实验至少重复3次.    2结果    2.1芹菜素对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响芹菜素可有效抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞系增殖随着浓度增加及作用时间的延长,各组增殖抑制率逐渐增加,具有浓度依赖性和时间依赖性.空自对照组,芹菜素10μM,20μM及40μM组处理细胞24h,各实验组增殖抑制率分别为6.94%,12.14%及26.59%,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05).    当芹菜素作用时间延长至48h,芹菜素对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用明显增强,各实验组增殖抑制率上升至8.64%,30.86%及56.17%,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05).两组组间差异具有统计学意义(P<0.05,表1).    2.2芹菜素诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞发生凋亡荧光染色结果显示,芹菜素可诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡.对照组未观察到明显的凋亡形态学改变(图1).芹菜素10μM组可见绿色荧光标记细胞(即凋亡小体),且随着芹菜素浓度的增加,各实验组凋亡小体数目逐渐增加,具有浓度依赖性芹菜素20μM,40μM组均可观察到明显的凋亡形态学改变.    流式细胞术结果显示,芹菜素可诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞发生早期凋亡.与对照组比较,实验组早期凋亡率逐渐增加,呈明显的量效关系(图2).空白对照组、芹菜素10μM,20μM及40μM组处理细胞24h,各组凋亡率分别为(0.92士0.063)%,(9.23士0.037)%、(19.80士0.046)%、(38.30士0.081)%,实验组与对照组比较差异具有统计学意义((P<0.05,表2).    Westernblot结果显示,与对贝翅r瞰,芹菜素10p,M、20p,M及40p,M组PARP及Caspase-3剪切带表达水平逐渐增加,具有浓度依赖性.此外,随芹菜素浓度增加,P73,PIG3与促凋亡蛋白Bax表调,而突变}.'tP53与Bcl-2均表达下调,呈明显量效关系(图3).各组Bax/Bcl-2比值分别为0.57士0.029,0.62士0.031,1.23士0.027,4.29士0.046,与芹菜素浓度呈正相关,实验组与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05).    RNA干扰结果显示,p73-siRNA可有效抑制PIG3蛋白表达(图4).空白对照组与实验组(芹菜素40p,M)PIG3表达分别降低了92.4%及89.9%,差异有统计学意义(P<0.05).此外,Caspase-3和PARP剪切含量也明显减少.Caspase-3剪切表达分别降低42.9%(空白对照组)及62.7%(实验组),PARP剪切表达则降低65.4%(空白对照组)及73.3%(实验组),差异具有统计学意义(P<0.05).    3讨论    乳腺癌已经成为全球女性最为常见的恶性肿瘤,其发病率呈逐年递增趋势.流行病学研究显示,受传统饮食习惯影响,豆类制品在亚洲人饮食结构中所占比例较高,与欧美女性比较,亚洲女性摧患乳腺癌风险相对较低7一豆类食品中包含黄酮类化合物,可以有效降低包括乳腺癌在内的多种激素依赖性肿瘤发病风险.芹菜素是存在于多种植物中的一种黄酮类药物,有文献报道,芹菜素可大幅降低乳腺癌发病率,且对多种肿瘤细胞产生增殖抑制作用.    然而,其作用机制尚不明确本研究发现,芹菜素可通过非P53依赖性途径诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞发生凋亡.    在倒置显微镜下观察,随着芹菜素浓度的增加,贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落现象,而在对照组中几乎观察不到此现象.同时,MTT实验结果表明,芹菜素能有效抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖,并呈现出明显的量效及时效关系:芹菜素对细胞增殖的抑制作用可能是通过诱导凋亡、阻滞细胞周期或抑制细胞生长实现的.为了进一步确定芹菜素对乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用,本研究应用荧光染色、流式细胞术及Westernblot等方法证实芹菜素可通过诱导凋亡来抑制MDA-MB-231细胞增殖.Yo-pro-1荧光染色观察到凋亡细胞的特征性形态学改变一凋亡小体形成,为芹菜素诱导的凋亡发生提供直接证据.流式细胞术检测结果显示,MDA-MB-231细胞发生早期凋亡比例逐渐增高,呈明显的量效关系,进一步证明芹菜素对乳腺癌MDA-MB-231细胞系的增殖抑制作用与细胞凋亡相关.此外,Caspase-3是细胞凋亡过程中重要的执行分子,而PARP是Caspase-3的主要切割底物,其在DNA损伤修复与细胞凋亡中发挥重要作用,底物PARP的剪切通常被认为是Caspase-3凋亡途径激活的标志污应用Westernblot检测技术,发现随着芹菜素浓度的增加,Caspase-3和PARP剪切带含量也随之增加,提示乳腺癌MDA-MB-231细胞发生凋亡以上实验结果表明,芹菜素是通过诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡来抑制细胞增殖的研究表明,肿瘤抑制基因p53与凋亡发生相关p53是细胞内重要的抑癌基因,其突变是导致肿瘤发生的重要原因.P53过表达源于DNA损伤,野生型P53可促进P21表达,后者通过下调细胞周期依赖性蛋自激酶CDK阻滞细胞周期,从而使细胞获得充分的时间修复损伤基因,维持细胞遗传的稳定.若基因修复失败,P53会促进Bax上调,并下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,从而诱导细胞凋亡"然而,MDA-MB-231是突变型P53高表达细胞株,突变型P53不仅降低P53的正常调节功能,还可促使细胞发生恶性转化_本研究发现,芹菜素处理MDA-MB-231细胞24b,突变型P53蛋白表达水平显著下降,且具有浓度依赖性,提示芹菜素可通过下调突变型P53表达促进MDA-MB-231细胞凋亡P53诱导基因3(PIG3是p53下游调控细胞凋亡的靶基因之一.    多项研究表明.PIGS参与合成活性氧簇(ROS),而后者是线粒体凋亡途径‘一扫的关键效应分子.ROS水平升高可降低线粒体跨膜电位,使线粒体释放细胞色素C,从而诱导凋亡产生因此,PIG3的激活在P53介导的细胞凋亡中发挥重要作用.本研究发现,随着芹菜素浓度的增加,PIG3表达随之增加,且具有浓度依赖性丁以上实验结果表明,乳腺癌MDA-MB-231凋亡可能与PIG3表达上调相关在乳腺癌MDA-MB-231细胞中,突变型P53高表达,且随着芹菜素浓度增加,其表达显著降低,提示PIG3不是由突变型P53诱导产生的另有研究表明’2,除P53以外,PIG3也可由P53蛋白家族中其他成员诱导产生P73是P53蛋白家族中的一员,其编码序列与p53基因高度同源与p53不同的是,p73在肿瘤细胞中极少发生变异或缺失’3研究表明,在p53突变或缺失的肿瘤细胞中,p73可代替p53靶向调节下游基因表达6(如P21,PIG3等),从而修复损伤基因,或诱导细胞发生凋亡本研究发现,随着芹菜素浓度增加,P73表达水平也有显著提高,提示乳腺癌MDA-MB-231细胞中PIG3的表达可能与p73激活有关.为了进一步确定p73在PIG3表达中的必要性,利用RNA干扰技术沉默.    基因实验结果显示,p73-siRNA可有效抑制PIG3蛋白表达,说明在乳腺癌MDA-MB-231细胞中,I'IG3的表达是P73依赖性的同时,Caspase-3和PARP剪切含量也显著降低,提示P73在调控乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡中起关键作用.因此,P73介导的PIG3表达可能是芹菜素诱导MDA-MB-231细胞凋亡的分子机制之一此外,Bcl-2家族是调节细胞凋亡中的重要因子,其中最重要的当属促凋亡蛋自Bax与抗凋亡蛋自Bcl-2,这两种蛋自在细胞凋亡过程中发挥决定性作用Bax蛋白与Bcl-2蛋自有21%的同源性,Bax不仅能和Bcl-2形成异源二聚体抑制细胞凋亡,而且其自身还能形成同源二聚体诱导凋亡发生’a研究表明,Bax/Bcl-2比值增加是细胞内源性凋亡发生的使动因素,当Bax/Bcl-2比值增高后,线粒体膜电位会发生改变,促进细胞色素C从线粒体释放到细胞质中,进而激活Caspaae-3,导致核内PARP发生剪切,从而诱导细胞凋亡.    本研究发现,芹菜素处理24h,Bax表达显著增加,而Bcl-2表达降低,Bax/Bcl-2比值逐渐增加实验结果表明,Bax/Bcl-2比值增加可能是芹菜素诱导MDA-MB-231细胞凋亡的又一分子机制综上所述,芹菜素可通过非P53依赖性凋亡有效抑制乳腺癌MDA-MB-23I细胞增殖,其主要机制可能与突变型P53表达下调,P73介导的PIG3表达上调,以及Bax/Bcl-2比值增加有关由于芹菜素对肿瘤细胞杀伤能力强,且在体内毒副作用小,芹菜素在不久的将来很有可能成为一种有效的辅助化疗药,特别是在预防肿瘤发生及防治肿瘤复发方面发挥自己的独特优势.    参考文献    1.Shukla S,Gupta S. 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